奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定.pdfVIP

· 8 · 《上海畜牧兽 医通讯》 2014年第 1期 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定 李 艳 徐 凯 赵 国琦。 (1盐城市农产品质量监督检验测试 中心 江苏 盐城 224002 2扬州大学动物科学与技术学院 江苏 扬州 225009) 【摘要】本试验通过组织块培养法获得 了奶牛乳腺上皮细胞 ，联合运用刮除法、相差消化和相 差贴壁法、单克隆法对细胞进行纯化 ，应用倒置显微镜和 8一酪蛋 白表达检测了体外培养的奶牛乳 腺上皮细胞的形态特征和乳蛋 白表达，鉴定该细胞为上皮型细胞。 关键词 ：奶牛乳腺上皮细胞 ；分离培养；鉴定 牛乳腺上皮细胞的培养 已有 5O多年的历史 ，作 组织块 ，并取适量种植于培养皿或培养瓶 中，放入 为一种高度分化的细胞，乳腺上皮细胞的体外培养 37℃、5 CO。培养箱 中培养。 比较困难。到 目前为止，国内尚无永生性奶牛乳腺 1．2．2 奶牛乳腺上皮细胞 的纯化 ：乳腺上皮细胞 上皮细胞系建立 的报道 。因此 ，建立具有正常功能 的纯化方法主要有刮除法 、相差消化法和相差贴壁 的奶牛乳腺上皮细胞系是非常有必要 的。国内外 法 ，一般情况下 3种方法同时使用才能得到较纯 的 研究者相继采用各种分离方法 ，大多选择组织块培 上皮细胞 ，此外还可 以用单克隆的方法纯化细胞。 养法 、酶消化培养法 、乳汁分离法等建立牛乳腺上 (1)刮除法 ：将培养瓶放在倒置显微镜下观察 ，用标 皮细胞的体外培养体系 ，并 以培养 的细胞为模 记笔在培养瓶底部勾戈0出上皮细胞集落 。在超净 型，对乳汁的合成和分泌机制进行了相关研究 。 台上 ，用细胞刮刀(或灭菌的枪头)将成纤维细胞 区 本试验 以组织块培养法获得 了较纯的上皮细胞 ，并 域刮除；用 PBS洗去刮下来 的细胞 ；再用胰蛋 白酶 以该细胞系为模型，研究其形态和基本功能。 消化上皮细胞 ，并用新鲜 的培养液重新悬浮 ，转移 1 材料和方法 至新的培养瓶继续培养 。(2)相差消化和相差贴壁 法 ：这两种方法主要是根据上皮细胞和成纤维细胞 1．1 试剂与材料 对胰蛋 白酶 的敏感性不 同进行分离纯化 的。先用 1．1．1 组织来源 ：健康 的荷斯坦奶牛屠宰后 ，在无 PBS洗涤细胞 ，加入含0．25 的胰蛋白酶的0．02 菌条件下选取脂肪较少且富含乳腺小叶的部位 ，放 EDTA消化液消化 l～2min，轻轻拍打培养瓶，再 置在预冷的DMEM ／F12培养基 中冰块保存 ，迅速 将消化液吸去。再加入 0．25 的上述酶溶液 37℃ 带 回实验室备用 。 消化 2～3min，加入 10 FBS—DMEM ／F12吹打 ，再 1．1．2 主要试剂 ：DMEM ／F12培养基 (Gibco)，胎 将细胞悬液移入新 的培养瓶 ；15～30rain后大部分 牛血清(Fetalbovineserum，FBS)(赛默飞产品)，胰 成纤维细胞已贴壁 ，乳腺上皮细胞基本上没贴或者 蛋 白酶 (Ameresco)，Trizol试剂 (Invitrogen)，反转 贴壁