实验三 蛋白质的性.pptVIP

* 实验三 蛋白质的性质实验 （一）蛋白质及氨基酸的呈色反应 （二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3、学习几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 4、了解蛋白质的两性解离性质。 5、学习测定蛋白质等电点的一种方法。 二、实验原理 Ⅰ、双缩脲呈色反应 尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一个NH3。双缩脲在碱性环境中能与Cu 2+结合生成粉红色（或淡紫红色）化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 Ⅱ、茚三酮反应 甘氨酸、蛋白质与茚三酮反应后的颜色和溶液的透 明度是否有差异，为什么？ 苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 Ⅳ、蛋白质等电点的测定 Ⅴ、蛋白质的沉淀及变性 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类： 1、可逆的沉淀反应 2、不可逆沉淀反应 1、可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构和理化性质尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。 2、不可逆沉淀反应： 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应等都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 三、操作方法 Ⅰ、双缩脲呈色反应 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10% 氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1% 硫酸铜溶液1滴，再振荡。 观察并记录颜色变化。 注意事项 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，还有那些物质有此反应？但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 在此设计双缩脲反应有何意义？需要注意他们反应后的颜色及反应速度有何差异；为什么？硫酸铜加入量要控制，否则将会产生蓝色氢氧化铜 Ⅱ、茚三酮反应操作方法 1、取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1ml，再各加0.1%茚三酮水溶液0.5ml，混匀，在沸水浴中加热1—2min，观察颜色变化。 2、在一小块滤纸上滴上一滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1%的茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 Ⅲ、黄色反应操作步骤 管 号 1 2 3 4 5 6 材 料 鸡蛋清溶液 指甲 头发 0.5% 苯酚 0.3% 色氨酸 0.3% 酪氨酸 （滴） 4 少许 少许 4 4 4 浓硝酸（滴） 2 1mL 1mL 4 4 4 现象 待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。 黄色反应为什么要引进苯酚，它的反应证明什么？ 注意彼此颜色和反应速度的差异（p21） Ⅳ、蛋白质等电点的测定 试管号 0.2mol/L pH3.8醋酸钠盐（ml） 0.2mol/L pH4.7醋酸钠盐（ml） 0.2mol/L pH5.8醋酸钠盐（ml） 0.2mol/L pH6.8磷酸钠盐 1 — — — — 2 1.0 — — — 3 — 1.0 — — 4 — — 1.0 — 5 — — — 1.0 取同样规格的试管5支均加入0.1mL酪蛋白溶液，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 *