鸡毒霉形体HS株pMGA多基因族序列分析研究.pdfVIP

中国备牧兽医学会禽病学分会第十次学术研讨会论文集 鸡毒霉形体HS株pMGA多基因族序列分析 沈青春 毕丁仁 翁长江 李 自力 (华中农业大学畜牧兽医学院.武汉,430070) 摘要 本研究用限制性核酸内切醉对鸡毒霉形体HS株基因文库中经初步估测可能含有4个pMGA基因的 MgW17重组质粒进行了不同组合的酶消化，根据消化片段的大小及酶切位点绘制了7.5k6外源片段的物理图谱; 然后根据所得的物理图谱，选用PstI和EcoRI将MgW17外源片段酶解成大小为1.3kb,2.Okb,4.2k63个部 分，分别亚克隆到SK(+)质拉上，得到了三个亚克隆子SGp100,SGp200、SGp300,使用核酸外切醉Ill缺失法构 建缺失子系列，经序列分析后得到Mgwl7外源片段的全部序列.阵分析可见序列全长74346p，中间含有两个完整 的pMGA基因和另两个不完整的pMGA基因的首部和尾部，分别将它们顺次命名为H-pMGAI.1,H-pMGAI.2, H-pMGAI.3和H-pMGAI.4，两个完整的pMGA基因的阅读框长度分别为19716p(1.2)和20436p(1.3)3H- pMGA1.l首部不完整的阅读框的长度为720bp，尾部不完整的H-pMGA.14的长度为1752bp。本文将H-pMGA 基因与已报道过的MG.S6株、F株的pMGA基因进行了比较，探讨了pMGA基因在不同MG菌株中的相似性、基 因启动子结构的差异、间隔区内GAA重复序列对转录调控的影响等q 关镇词 鸡毒霭形体 pMGA多基因蜘 序列分析 t 鸡毒霉形体(Mycoplasmagallisepticum,MG)是引起鸡、火鸡及其它禽类慢性呼吸道病的病原 菌。MG能借助于细胞表面的一种起粘附作用的蛋白吸附于宿主细胞表面，在局部大量繁殖，造成 病理损伤，这种粘附蛋白称为鸡毒霉形体粘附蛋白(proteinofMycoplomagallisepticumadhesin), 简称粘附素(pMGA)[，二。Markham(1993)-f]提纯了MGS6株细胞表面的pMGA分子并进行了部 分测序，并分析了S6株基因组中的一个lokb的EcoRl片段，其中含有2个pMGA基因;Baseggio (1996)-对7个MG菌株进行了分析，证实每个菌株基因组内的pMGA基因拷贝数在32^-70个 之间，因此，pMGA基因是MG基因组中一个大的基因家族，能对宿主免疫系统提呈多达几十种抗 原性有差异的粘附素，以此躲避宿主免疫系统的攻击，另有人报道，MGC1,MGC2,gapA,M9等， 可能也是与吸附作用有关的MG的表面蛋白〔卜0]1。 鸡毒霉形体HS株是毕丁仁(1989)从某鸡场分离的一个强毒菌株[31.121，我们以PUC18为载 体，构建了HS株基因文库，使用pMGA基因的首部和间隔区的保守序列人工合成了两个寡核昔 酸探针，从文库中挑选了一个7.5kb的外源片段(MgW17)，通过酶切转膜,Southernblotting，放射 性信号强度分析，大致估计了MgW17片段可能含有4个pMGA基因。并以此为依据，估计出HS 株基因组可能含有41个pMGA基因。本实验的目的是将MgW17外源片段进行全序列分析，探讨 该片段的核昔酸的排列顺序、pMGA基因的确切数目及其特征，并比较HS-pMGA基因与S6株，F 株pMGA基因在核昔酸序列、启动子结构、间隔区重复序列、编码蛋白的氨基基结构等方面的一致 性，以进一步探讨鸡霉形体pMGA基因的分子生物学特征。 1材料与方法 1.1MgW17重组质粒菌 来自鸡毒霉形体HS株的pUC18文库，含有7.5kbMG.HS株基因片 段根据酶切消化、Southernblotting、杂交片段的放射性信号强度分析，7.5kb片段可能含有4个 pMGA基因。各种工具酶及菌株购自华美、Promega、原平浩等生物公司 一 208 一 中国畜牧兽医学会禽病学分会第十次学术研讨会论文集 1.2MgW17重组质粒外源片段酶切分析及物理图谱的构建 挑取MgW17质粒单个菌落到2.1 含100pg/ml氨节青霉素的LB培养基中，37C震荡培养10小时，将菌液12000r/min离心lOmin, 弃上清，按常规方法提取质粒，凝胶电