我国嗜热弯曲菌PCR和核酸探针检测方法的建立与应用.pdf

我国嗜热弯曲菌PcR和核酸探针检测方法的建立及应用 摘要 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌是我国主要的嗜热弯曲菌，可以引起人和动物发生 多种疾病，并且是食物源性病原菌，在一定范围上所引起的食源性细菌感染已超 过沙门氏菌，成为在腹泻病人中最常分离到病原菌，对禽类产品安令和人类健康 造成了严重的威胁。目前，嗜热弯曲菌已成为我国进出口禽类产品检测的主要痫 原菌之一。 在出入境检验检疫中，样品中的病原菌检验，按现行标准(GB国家标准和 SN行业标准)，然而传统方法中难免有操作繁琐、步骤多、检验周期长的问题， 不能满足大批样品检验检疫的需要是对外贸易的一个急待解决的制约因素。 本研究建立了检测我国嗜热弯曲菌的PcR和核酸探针检测方法，简化了检 验流程、提高检测效率，并应用于实际样品的检测。选择空肠／结肠弯曲菌同源 性较高的16SrRNA为扩增目的基因，应用Primer5o软件设计引物，建立快速检 测鸡肉中空肠／结肠弯曲菌的PCR方法。PCR循环参数为：94℃预变性4fnin、 最佳反应条件为：模板lo‘3倍稀释，引物最佳浓度为O．4¨mol／L，MgCl2最佳浓 度为1，Ommol几。该方法能够特异性的扩增出空肠／结肠弯曲菌287bp核苷酸片 段，而对胎儿弯曲菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、产气夹膜 梭菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌和单核细胞增生性李斯特氏 菌等非空肠／结肠弯曲菌均不能扩增出目的片段，敏感性试验的检测限度为 5cfll／mL。 在PcR方法建立的基础上，在已扩增的特异性和敏感性较好的空肠／结肠弯 曲菌16S“州A上设计核酸探针，探针大小2lb口，具有寡核苷酸探针的优点。此 方法利用化学发光物质吖啶酯标记寡核苷酸探针，所设计的探针能够与目的核苷 酸探针杂交，形成DNA—RNA杂交体，杂交后无需分离步骤，利用差分水解 发光特性(半衰期小于1rnin)，而与靶细胞杂交的探针可以保护吖啶酯不在碱性 环境下水解。因为吖啶酯平面结构镶嵌于杂交体双螺旋的内部，受到空间位阻的 保护，水解速度缓慢(半衰期10min以上)，仍有发光性能，再加入碱性H202 进行检测时，能够在发光仪上检测到发光，整个试验过程只需要30min。此方法 称为核酸杂交保护分析，目前在我国还很少应用。 取空肠弯曲菌标准株的纯培养菌落进行核酸杂交保护分析的试验，通过条件 的筛选和优化，此方法能够特异性的检测出窄肠／结肠弯曲菌，而对胎儿弯曲菌、 肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、副溶血性弧菌、产气夹膜梭菌、绿脓假单胞菌、单 增李斯特杆菌等非空肠／结肠弯曲菌均检测为阴性结果。挑取不同个数的阳性菌 落进行敏感性试验，最低检测限度为1个菌落。 将建立的PcR方法和核酸杂交保护分析方法应用于送检的100份鸡肉样品 的检测，在分离培养的过程中，分别提取鸡肉肉水、增菌液和纯培养菌落进行 PCR检测，对纯培养菌落进行核酸杂交保护分析检测，并与常规生化鉴定结果 应用结果显示，本研究所建了的检测我国嗜热弯曲菌的PCR方法和核酸杂 交保护分析方法具有简便、快速、准确可靠的优势，具有广泛的应用价值。 关键词：嗜热弯曲菌，P嘛，核酸探针，应用 Ⅱ Establishmentand ofPCRandNucleic Application Acid MethodstoDetect inChina Hyb“dization Thermcampylobacter Abtract and coli(Ccoli)aremajor 弼眦i(C厕IlIli) Canlpylobacter Callwlobacter c弛causediseasesofhumananda11imaisare many Theystuff_0riginal 山emcampylobacter，they