成体兔转基因成纤维细胞的克隆分离及其核移植研究-生物化学与生物.PDFVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(9): 1186~1192 体兔转基因 纤维细胞的克隆分离 及其核移植研究* 1,2)** 1)** 1) 1) 1) 张传山 郭 毅 谷瑞环 李善刚 李 峰 2) 3) 1) 2)*** 1)*** 王 伟 丁 雷 邢凤英 姚 刚 陈学进 1) 2) ( 上海交通大学医学院实验动物科学部，上海200025 ；新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐830052； 3)东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨150040) 摘要 哺乳动物体细胞核移植及其与转基因技术的结合为转基因动物的研究提供了新的思路和方法 然而，单个转基因细胞 克隆的分离培养一直比较困难，很大程度上限制了转基因动物的研制 将pRNAT-U6.1/Neo 质粒转染成体兔成纤维细胞，通 过24 孔细胞培养板分离培养法获得来源于单个转基因成纤维细胞克隆 由于单个成纤维细胞克隆在新鲜DMEM 培养液中生 长比较困难或缓慢，采用由DMEM/F12 制备的条件性培养液进行筛选 以转基因成纤维细胞为供体细胞进行核移植，囊胚 率为23.5%，与来源于成体兔正常成纤维细胞相比较差异不显著 并且利用PCR 或多重PCR 方法鉴定筛选的转基因细胞克 隆及其核移植胚胎中整合的NeoR 基因和常染色体 -actin DNA 为转基因哺乳动物细胞的分离培养和核移植胚胎的鉴定提供 可靠的方法，缩短了转基因动物的研制周期，降低生产成本，同时为进一步通过核移植技术获得转基因克隆兔提供了条件 关键词 成体兔，细胞分离，多重PCR，核移植，转基因检测 学科分类号 Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00065 转基因技术在牛、羊、猪等家畜 的成功应 节的限制 如核移植之后胞质卵裂产生的一些非转 用，为培育基因组修饰动物、改良家畜品种、研制 基因胚胎可能被移植到受体动物，转基因体细胞系 人类疾病模型、研究动物机体代谢和基因表达机 的分离培养相对较难，细胞的传代次数有限等 因 制、制备生物反应器等提供了一种革命性的手段 此，建 一种有效的转基因体细胞克隆分离的方法 显微注射是发展最早、应用比较广泛的生产转基因 以及核移植转基因胚胎鉴定的方法成为提高转基因 动物的技术，但是该技术存在不足之处，如外源基 动物生产效率的关键 因整合效率低且具有随机性、成本高、生产周期长 本实验提供了一种快速分离培养来源于单个转 [1] 以及嵌合体的繁殖相对困难等 并且现在一般通 基因成纤维细胞克隆的方法，以及利用PCR 方法 过PCR 方法来检测由显微注射制备的转基因胚 鉴定核移植转基因胚胎的方法 以转基因成纤维细 [2] 胎 ，显微注射槽或游离质粒的影响也使该方法鉴 胞为供体细胞进行核移植，获得发育到囊胚的转基 定结果的假阳性率较高[3, 4] 因兔胚胎，通过PCR 方法鉴定单个转基因成体兔 与显微注射技术相比，哺乳动物体细胞核移植 R