活细胞工作站的应用-重点试验室.PPT

形态暨影像公共平台 生理129室 形态暨影像公共平台 激光共聚焦显微镜 (Laser Scan Confocal Microscope，LSCM， Leica) 流式细胞仪 (Flow cytometry，BD) 激光共聚焦显微镜 (Laser Scan Confocal Microscope) 仪器名称：Leica 激光共聚焦显微镜 型号：Leica TCS SP5 II 国别：德国徕卡 主要技术指标 1. 激光器： HeNe Red: 633nm； HeNe Green: 543nm； Ar: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm； 近紫外: 405nm。 2. 检测通道：3个光谱型检测通道，检测波长范围400-800nm。 3. 扫描系统： 线扫描速度(双向) ：2800线/sec，连续可调； 扫描分辨率：8192×8192像素； 最大帧频：512×512 物镜的配置 10×； 20×； 40×； 63×(油镜)； 63×(水镜)； 利用水浸物镜进行长期活细胞观察 水浸物镜可以获得最高的分辨率和对比度。自动加水设备，保证移入样本后对比度不会下降。无对焦错误,运动过程中水膜不会破裂。 应用范围： 用于研究亚细胞结构、细胞内的物质(囊泡、细胞器、蛋白质复合体等的转运、分子相互作用、细胞骨架的动态变化、细胞分裂和细胞器发生过程等); 对细胞内结构和活动进行准确的定性、定量、定时和定位分布观察。研究方法包括免疫荧光染色（单染、双染、三染）、活细胞荧光标标记、FRAP(Flourescence Recovery After Photo-bleaching)、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)等。 活细胞工作站的应用 (Live cell imaging system ) 荧光标记蛋白的长时间跟踪观测 活细胞运动及形态跟踪观测 荧光共定位 荧光共振能量转移FRET 荧光图像处理、测量 活细胞工作站的优点 实时观测 自动聚焦 单细胞追踪 多位点成像 成像速度快 活细胞工作站与共聚焦的区别 活细胞工作站： 细胞立体感强 成像速度快：＜500ms 光毒性小 多点拍摄 主要用于活细胞实时观察（GFP，CFP、YFP，RFP） 激光共聚焦： 平面扫描 成像速度慢：1-2 min 清晰度较好 光毒性 主要用于固定后的组织、细胞。 活细胞实验条件的控制 温度的保持；（加热的载物台，加热循环空气，物镜加热器，恒温箱） pH值的保持，即CO2的供应（5% CO2）； 培养基离子浓度的保持； O2（95% O2）的要求。 标本的准备要点 尽量使用0.17mm厚玻璃底的培养皿（Lab Ｔｅｋ） 因为高数值孔经径物镜能发挥其最大效应。 对于不容易在玻璃上生长的细胞，使用包被了poly-lysine 或相似物质的玻璃底培养皿。 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP） 可溶性蛋白，性质稳定。 荧光基团明亮。 荧光在活细胞中即可观察，不需固定和加工。 GFP基团和目的基因做成融合蛋白后，可以通过转染的方法在细胞中稳定表达。 表达GFP融合产物的细胞能在活的状态下进行实验和检测。 Transfection Incubate the cells: 30-40% or 70%-80% confluence. Transfection: lipofectamine 2000 Transient transfection: used for imaging directly. Select stable cell lines: 48h, G418, 2-3weeks. Check whether pDsRed1-mito can probe mitochondria in CMs by using confocal microscope 生理楼2012.09.04 Mito Green pDsRed1 Mito Merge X63 X63 2.5 h * *