慢病毒介导CD36基因沉默细胞株的构建及其对.PDFVIP

110 生 物 工 程 学 报 李敬达 等/慢病毒介导 CD36 基因沉默细胞株的构建及其对caveolin-1 蛋白表达的影响 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn January 25, 2018, 34(1): 110−121 DOI: 10.13345/j.cjb.170135 ©2018 Chin J Biotech, All rights reserved ·医学与免疫生物技术· CD36 caveolin-1 1,2 2 2 2 1 2 李敬达 ，余承洁 ，王仁军 ，付常振 ，修志龙 ，刘庆平 1 116024 2 116600 , , , . CD36 caveolin-1 . , 2018, 34(1): 110–121. Li JD, Yu CJ, Wang RJ, et al. Construction of CD36 gene silencing cell lines by lentivirus-mediated RNA interference and the effect on protein expression of caveolin-1. Chin J Biotech, 2018, 34(1): 110–121. 摘 要 : CD36 作为重要的清道夫受体密切参与了巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取作用，为了进一步研究 CD36 的功能，本文利用慢病毒介导的shRNA 干扰技术，构建了CD36 基因沉默巨噬细胞 (J774A.1) 株，并以此 为模型分析了CD36 在caveolin-1 蛋白表达过程中的作用。首先，针对CD36 基因序列设计合成 5 条shRNA 片段， 并构建得到pLKO.1-CD36-shRNA 慢病毒干扰载体，测序鉴定后与psiCHECK- Ⅱ-CD36 载体共转染入293T 细胞 中，筛选出有效的CD36-shRNA 。将慢病毒干扰载体与病毒包装质粒共转染入293T 细胞，包装得到慢病毒颗粒， 之后感染J774A.1 细胞，经嘌呤霉素筛选后得到CD36 基因沉默稳转细胞株。Western blotting 及激光共聚焦检测 结果表明CD36 基因沉默效率达 90% ，并且伴随着CD36 的基因沉默，与之结合的DiI-oxLDL 也随之大幅降低， 证明构建成功具有良好生物学活性的 CD36 基因沉默细胞株。最后，抑制剂处理及 oxLDL 给药刺激实验结果表 明，CD36 的基因沉默能够显著降低JNK 及ERK 的磷酸化水平，进而抑制了caveolin-1 的蛋白表达，表明CD36 能够经由JNK 及EKR 信号传导调节caveolin-1 的蛋白表达。 : CD36 受体，shRNA 基因干扰，氧化低密度脂蛋白，Caveolin-1 ，巨噬细胞 Received: March 31, 2017; Accepted: April 20, 2017 Supported by: Notional Natural Science Foundation of China (No.. Corresponding author: Qingping Liu. Tel: +86-411 E-mail: qingpingliu40@126.com (No. 李敬达 等/慢病毒介导 CD36 基因沉默细胞株的构建及其对caveolin-1 蛋白表达的影响 111 Cons