高效液相分析方法开发1-缓冲液或酸的体系选择.pdf

能够开发一个新方法对于HPLC 的初学者来说有很大吸引力，但是新手往往会感觉无法下手，其实完全不是那么一 回事，只要你有一台双泵或者四元泵的HPLC，看了本文，就可以上手去做了。 首先我们要保证的一个根本原则是： 我们要做出来的是一个有稳定，明显的分离，并且在检测器的响应明显，有定量理论基础的方法。 这句话中的“稳定”、“明显”是必要条件，有一点不达标方法就没意义。 然后，对于新手来说，最好遵守这样一个小原则：我们从不新建，我们只是套用。 你已经接触到或看到的HPLC 检测条件，反相的条件下，有机相不外乎甲醇乙腈，水相稍微复杂点，但也就是 那么几套缓冲液或酸的体系。那么我们建立方法时候如何选择它们呢？它们都有什么区别呢？听我一一道来。 先讲有机相，选择甲醇或是乙腈？在一般条件下，我给你这样的建议：你平时用甲醇多，就用甲醇的条件；平 时用乙腈多，就用乙腈的条件。建立的方法，少不得自己要用，当然是自己越方便越好。如果能使用和其他常做的 样品一样或相似的条件，会省下很多工作量和时间。甲醇和乙腈是的主要区别，就是乙腈价格贵，毒性大，但是洗 脱能力强——通俗点讲，就是把柱子里面的样品冲出来的能力比甲醇高，比如50%的甲醇水和35%的乙腈水做同 样的样品出峰时间可能差不多，当然，有的样品也许出现相反的情况，我们只讲大多数。甲醇的特点就是便宜，毒 性相对小，洗脱力差。还有一个要注意的是，甲醇在低波长（低于 210nm ）的检测条件下，一般是不用的。因为 本身有紫外吸收，会让你的基线很难看——你不用紫外或DAD 检测器？哦，当我没说。至于甲醇是质子体，乙腈 不是的话题，我们不展开说原理和区别了，一般来说知道有这回事就好，那就是有时用乙腈分不开或峰型难看的样 品，换了甲醇会好很多，这样的样品并不多见，大多数时候水相会承担甲醇的这个作用。 水相的体系选择要复杂点，一般常见的酸性体系有磷酸，甲酸，乙酸，三氟乙酸，高氯酸等，由于现在的色谱 柱绝大部分都是硅胶填的，碱性的液体会跟硅胶起作用，所以碱性的流动相体系不常用，很特别的色谱柱广告宣传 可以在 pH=12 下使用，那是针对特别的样品了。缓冲盐体系有磷酸缓冲盐体系，三乙胺缓冲体系（一般用乙酸或 磷酸调整其pH），乙酸铵缓冲体系等。其他的就是离子对试剂，X 烷磺酸纳，四丁基X 铵之类，也算他们是缓冲盐 吧。注意，缓冲盐的适用波长参照其对应的酸，另外，缓冲盐一般都不适用于液质联用和蒸发光散射检测器。 下面是重点内容了，先声明，我介绍的是自己的经验，有大方向不对的请多指正，但是化学品结构千变万化， 有个性的样品也不是没有，不可能有个统一的理论适用于所有样品，因此个案我就抛在一边，你运气不好遇到了无 非多试几个流动相体系而已，不要跑来找我算账，说我文章里怎么怎么说了，你听了我的话浪费感情的话，我不承 担责任的。 什么情况下用酸，用什么酸？回答：对于有酸碱性的样品，酸都是很好的选择。选择的原则就是，保证pKa 和 流动相内的 pH 相差2 以上（我们仪器信息网有个《常见化合物 PKa 数值表》，pdf 文件，五星推荐）。忘记 pKa 是什么东西的同学们，如果不想看书的话，我告诉你我的理解：就是保证我们的酸比样品的酸性强很多或弱很多， 如果样品是碱性，那么要比它对应的酸性强很多或弱很多，总之不和样品接近 （一般我们选择强于样品的酸性）。 选择顺序是：按需求来，优先考虑有机酸，优先考虑腐蚀性小的酸。出来混的都不容易，能用安全的当然要用安全 的。 希望下个表格能对你有所帮助。 什么情况下用缓冲盐？单独用酸不行的时候用缓冲盐。如果样品的粒子性不强，那单独靠 pH 的抑制不起作用 的时候，需要加一些盐进去，进行其他方面的抑制。一般情况下，磷酸缓冲体系是首选，因为配制简单。有时我们 也会用到三乙胺，但是现在它的出场几率越来越少。因为色谱柱的科技含量越来越高，绝大部分色谱柱都是封尾过 的。所以曾经大受欢迎的扫尾剂三乙胺的作用越来越小。如果不考虑pH 的影响，三乙胺大部分时候只能锦上添花， 雪中送炭指望不上了。就是说，如果峰型有点难看，但还是凑合，那么可以考虑加点进去改善一下；如果已经惨不 忍睹，那就要考虑其他因素，三乙胺加了作用不大。缓冲盐的选择原则是：越简单越稳定就越好。缓冲能力要强， 如果受到一点影响pH 就会有明显变化，那保留时间就可能飘；配制要简单，需要调pH 值的话也要有相应的酸或 碱。别问我为什么不用盐酸，我前面说过了，我们不新建，我们只是套用。为什么我们要冒风险去选择大多数人都 不用的东西呢。另外，除非你手头有类似的结构采用离子对试剂的成熟方法，或者你有大量的HPLC 使用经验（这 样