内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-I在大肠杆菌.PDFVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, August 25; 26(8): 1128−1134 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn ©2010 CJB, All rights reserved. 生物技术与方法 内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-I 在大肠杆菌 中融合表达及活性分析 吕凤霞，陆兆新，别小妹，林谦，张充，曹林，郭瑶，汤彦翀 南京农业大学食品科技学院 酶工程研究室，南京 210095 摘 要: 以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3 基因组DNA 为模板，PCR 扩增PPFE-I 基因，并克隆到pMD19-T 载体上，构建 克隆载体 pMD-PPFE-I ，经测序正确后，将 PPFE-I 基因克隆至表达载体 pET-DsbA 上构建重组表达质粒 pET-DsbA/PPFE-I ，将其转化至E. coli BL21(DE3) ，在IPTG 诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-I 的表达，表达产物酶 活性达228 IU/mL 。表达产物用SDS和Western blotting 进行鉴定。SDS电泳检测表明融合蛋白主要以可 溶形式表达，占菌体总蛋白的 18.4 ％。Western blotting 结果表明在相应分子量处有一条特异性条带，证实该蛋白为 DsbA-PPFE-I 融合蛋白。表达产物通过 Ni 亲和柱、凝血酶酶切及 Sephadex G-100 等步骤进行分离纯化，并用 MALDI-TOF 质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。 关键词: 内生菌，多粘类芽胞杆菌，纤溶酶，基因克隆，融合表达 Fusion expression of fibrinolytic enzyme gene PPFE-I from endophytic Paenibacillus polymyxa in Escherichia coli and activity analysis Fengxia Lü, Zhaoxin Lu, Xiaomei Bie, Qian Lin, Chong Zhang, Lin Cao, Yao Guo, and Yanchong Tang Laboratory of Enzyme Engineering , College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China Abstract: With the genomic DNA of strain EJS-3 as the template, we amplified the gene of fibrinolytic enzyme from Paenibacillus polymyxa (PPFE-I) by PCR. We purified the PCR product and ligated it into pMD19-T. After DNA sequencing, we cloned the PPFE-I gene into expression vector pET-DsbA and transformed it into Escherichia coli BL21(DE3). Upon induction of IPTG, we found that the activity of recombinant fibrinolytic enzyme fused with DsbA expressed in Escherichia coli was 228 IU/mL. SDSanalysis showed that the recombinant enzym