聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用..ppt

第四章  电泳技术 第一节 概 述 电泳的定义 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。 电泳技术的发展过程 1809年俄国物理学家Peнce发现电泳现象。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。 1937年瑞典的Tiselius建立了分离蛋白质的界面电泳。 电泳技术的应用： 1、小分子物质的分离分析 2、蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。 (主要用于物质性质的研究、种类的鉴定、分离纯化、纯度的分析等。) 电泳技术已成为生物化学、分子生物学、医学、药学、农业、食品、卫生、环保等学科不可缺少的重要工具。 一、电泳的基本原理 各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于溶液终的H+浓度。 带电的颗粒在电场中移动时，受到两种力的作用： 1、电场 (F1)，它能使带电粒子移动。 2、移动的粒子和溶液介质之间产生的摩擦力(F2)。 两种力的公式如下： Fl=q· E (1) 式中 q：粒子所带的净电荷；E：电场强度。 F2=f· V (2) 式中 f：摩擦系数；V：粒子的运动速度。 对于一个球形质点，根据Stokes定律 f =6πηγ 故在电场中运动的粒子，其所受到的电场力和摩擦力相平衡，即 q·E=6πηγ·V (3) V（F’）= q·E / 6πηγ (4) 从公式(4)可以看出，粒子在电场中运动的速度和它所带的净电荷及电场强度成正比，和溶液的粘度与粒子的大小成反比。 但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。 即 (6) 式中 L：粒子的迁移距离；t：泳动时间；E：电场强度。 将(5)代入(6)，得到 Q m = ———— (7) 6πr 由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。从(6)式可以导出迁移率的单位是cm2·s-1·V-1。 二、影响颗粒电泳迁移率的因素 （一）缓冲液 1、缓冲液的 pH 缓冲液的pH决定被分离物质的解离和带电性质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。 例如：若溶液pH＜pI，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pHpH＞pI，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pI越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。 2、缓冲液的离子强度 缓冲液的离子强度一般以0.05～0.10mol/L浓度为宜。 离子强度低，产热少，电泳快，区带明显扩散。 离子强度高，区带尖锐，泳动距离短，产热多。 缓冲液中的离子浓度增加会引起质点迁移率的降低。