[教学]分子生物学-03复制.pptVIP

Molecular Biology Biotechnology Institute Hu Dongwei hudw@zju.edu.cn 第三章 DNA的复制 引发过程： DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开 合成RNA引物分子，分开双链DNA链 单链DNA结合蛋白(SSB)结合在被解开的链上 复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n‘蛋白)，n“蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，与单链DNA结合生成中间物 引发前体与引物酶(primase)组装成引发体(primosome) 引发体在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置 引发体首先在前导链上合成RNA引物，然后在后续链上沿5‘→3’方向不停的移动，在一定距离上反复合成RNA引物。 正超螺旋的解除 （1）DNA解链而产生正超螺旋可以被原来存在的负超螺旋所中和； （2）DNA拓扑异构酶I可以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；而DNA拓扑异构酶II（旋转酶）可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链。 DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶III催化，由7种多肽组成。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。α亚基具有聚合功能和5→3外切酶活性，ε亚基具有3→5外切酶活性。另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。 在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶III在同一时间分别进行复制DNA前导链和后续链。如果后续链模板环绕DNA聚合酶III全酶，并通过DNA聚合酶III，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则后续链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。 当DNA聚合酶III沿着后续链模板移动时，遇到RNA引物后就开始延伸合成。到达前一冈崎片段时停止。复制叉继续向前运动，产生了又一后续链冈崎片段。 DNA复制体(replisome)：在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶III全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体。复制体在DNA前导链模板和后续链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的后续链。 在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶III的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶I通过其5→3外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5→3合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA后续链。 DNA复制的终止 　　DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合I所填充。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少。线性DNA分子两端是靠端粒酶完成其复制。 六、DNA复制的真实性 大肠杆菌中，每复制109-1010个核苷酸便要出现一个误差。每1000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正常的核苷酸。如果单纯靠碱基对原则来维持其DNA复制准确性的话，那么误差出现的频率将为10-4-10-5。因而，在细胞内除了碱基对原则外，必然还有其他因子的作用，来维持DNA复制的准确性。 DNA聚合酶本身具有校对作用 按碱基配对原则，错误核苷酸掺入的机率为10-4-10-5，然后，DNA聚合酶本身的校对作用又可以使错误核苷酸掺入的机率为10-4-10-5。这样，每掺入一个核苷酸，发生错误的机会只有10-8-10-10。 引物RNA的切除 DNA复制开始时掺入的核苷酸往往容易出错。RNA引物可以被切除，不会影响DNA的准确性。 真核生物DNA聚合酶无3→5外切酶活性。因此，可能存在其他校正机制以保证DNA复制的准确性。 七、环状DNA的复制的方式 1．θ型复制 环状DNA可以采取上述典型的DNA复制方式进行复制，即从复制起点开始，双向同时进行，形成θ样中间物，故又称θ型复制，最后两个复制方向相遇而终止复制。 2．滚环复制(Rolling circle) 亲代双链DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5‘端游离出来并且很快被单链结合蛋白结合。同时环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3’-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸。 在DNA解链时不会产生超螺旋。当5-端从环上解下来后不久，即与单链结合蛋白结合，以后可移动的引发体便在其上形成，以引发RNA引物的合成，然后由