谷氨酸产生菌的原生质体形成与再生研究.pdf

谷氨酸产生菌的原生质体形成与再生 张克旭陈宁 (天津科技大学生物工程系天津300222) 原生质体融合技术是利用微生物所具有的自然基因重组能力，不需要弄清基因 图及开发载体一寄主系统，只需要通过与高产菌株进行原生质体融合就可选育 出目的产物产量更高的生产菌株，利用原生质体融合方法选育氨基酸高产菌具 有重要意义。众所周知，原生质体的制备是原生质体融合的基本条件，但酶解去 壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能 生长、分裂，这是原生质体融合的必要条件。由于原生质体的形成与再生受到多 种因素的影响，为了获得最佳的原生质体形成率与再生率，必须对其进行研究。 1材料与方法 1．1菌种 黄色短杆菌(Brevibacterium umtianjinese)TG961，均为天津科技大学代谢控制发酵研究室保存菌种。 1．2完全培养基(g／L) ’ 蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，Nacl 20min 2．5，琼脂20，pH7．0，0．75kg／cm2 1．3再生完全培养基 葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl 2．5，丁二酸钠135，MgCla 2．0，EDTA1．9，DNase 20min 5ng，琼脂20，pH7．0，0．75kg／em2 1．4主要溶液 1．4．1高渗液 丁二酸钠13．59，M#hO．29，EDTA 灭菌后，在使用前加入DNase 0．5mg。 I．4．2蛋清溶菌酶溶液 Ig蛋清溶菌酶+100mL灭菌的高渗液，混匀后用G5细菌过滤器过滤除菌。 I．4．3青霉素G钾盐溶液 将青霉素G钾盐(160万单位)用无菌水配成50U／mL溶液，现用现配。 1．5菌体前培养 ·26· 取新鲜活化斜面菌种一环，接入装有30mL完全液体培养基的250mL三角瓶． 中，30。C，96r／min，振荡培养过夜，取lmL菌液到另一完全液体培养基中，30℃， 96r／min振荡培养5h，加入一定浓度的青霉素，继续培养1．5—2ho 1．6原生质体的形成 取上述经青霉素预处理过的菌液各5mL于两个离心管中，4000r／min离心 10min，弃上清，用高渗液洗涤2次后，配成高渗菌悬液5mLo加入蛋清溶菌酶， 离心10rain，弃上清，用高渗液洗涤2次后，配成高渗菌悬液5mL。 1．7原生质体的再生 将原生质体高渗悬浮液用高渗液适当稀释，取0．5mL稀释菌液与融化后冷 至45℃(水浴保温)的半固体再生完全培养基4．5mL混合后，均匀倾注在已固化 的再生完全培养基底层平板上，30℃培养48—72h。 1．8原生质体形成率和再生率的计算 将经青霉素处理后，溶菌酶处理前的菌液，经无菌水系列稀释，取0．2mL菌 液均匀涂布于完全培养基平板上，30。C培养。根据长出的菌落数计算原菌数 (A)o 将获得的原生质体分别经如下两个过程处理：1)用无菌水适当稀释，取 0．2ITlI稀释菌液均匀涂布于完全培养基平板上，30℃恒温培养，在完全培养基平 板上长出的菌落数即为未形成原生质体的菌数(B)。2)用高渗液适当稀释，取 0．2Il】I稀释菌液均匀培养在再生完全培养基平板上，30℃恒温培养，计数，长出的 菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的菌数之和(C)，则原生质体形 成率和再生率的计算式如下： 原生质体形成率(％)=生≠×100 n 原生质体再生率(％)=}薯×100 n—U 2结果与讨论 2．1亲株对数生长曲线的