遗传转化 农杆菌ZPPT.pptVIP

实验八 植物的遗传转化 ;? 主要方法有： DNA直接导入基因转化 1 化学诱导DNA直接转化 2 物理法诱导DNA直接转化 种质系统介导基因转化 1 花粉管通道法介导基因转化 2 生殖细胞浸泡法介导基因转化 3 胚囊、子房注射法介导基因转化 生物介导的基因转化 1 植物病毒介导的基因转化 2 农杆菌介导的基因转化 ;农杆菌介导的基因转移 1? 农杆菌简介 ? 革兰氏阴性土壤杆菌。 根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens): Ti质粒 ,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤 ,即诱发冠瘿瘤 ; 发根农杆菌 (Agrobacteriumrhizogenes): Ri质粒 ,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。 根癌农杆菌属于根瘤菌科,农杆菌属,革兰氏阴性菌。好氧，最适生长温度为25-30℃，最佳生长pH为6.0-9.0，研究表明，双子叶植物中有93属643种对农杆菌敏感，而单子叶植物则普遍不敏感。 ;2.根癌农杆菌致瘤的机制 根癌农杆菌Ti的致瘤过程需要如下条件： 植物的损伤信号及环境因子。 菌体的识别和附着位点。 Ti质粒的必需组成元件，包括T－DNA区域和 致毒基因(Vir gene)。 位于根癌农杆菌染色体上的一些其他遗传座位 ;植物损伤信号及环境因子 植物损伤信号（糖类和酚类化合物）可指导农杆菌对植物细胞的趋化性移动，并可诱导农杆菌Vir基因的表达。 化学诱导信号中最强的为酚类化合物，包括儿茶酚、没食子酸、香草醛，乙酰丁香酮等, 以乙酰丁香酮的诱导效果最佳。 。 ;T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时， 从Ti质 粒上切割下来转移到植物 细胞上的一段DNA Vir区：毒性区，激活T-DNA转移。 Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接 合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在 农杆菌之间的转移。 Ori区：复制起始区 染色体上的一些其他遗传座位 这些基因在致瘤过程中具有决定农杆菌细胞表面特性和调控Ti质粒Vir基因的表达的作用。 ;土壤农杆菌介导转化;1. 农杆菌的培养 培养基： LB, YEM, YEB 生长周期: 固体培养1-2天，液体培养2-3天??? 农杆菌接种后，一般需要在25-30 ℃的条件下，1-2小时才开始分裂。因此当用抗生素筛选菌株时，需要在液体培养液中2小时后再加入抗生素，以便让抗性基因充分表达。 ;3．外植体的选择 转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期 细胞分裂周期的的S期（ DNA合成期） 合子胚、体细胞胚或者胚性细胞。 性质未定细胞： 分生组织， 微管形成层，静止薄壁组织及胚，雌、雄配子体，这些组织的细胞具有很强的分生能力，而且发育性质未定，当这些组织发生创伤或者环境因素诱导时，则加速分裂，形成愈伤组织或者迅速分化，趋向某一器官的发育、处于转化的敏感期。 ;4．外植体的农杆菌接种 将外植体先切成小块，然后浸泡在制备好的农杆菌菌液中，浸泡一定时间后，然后用无菌滤纸吸干 注意事项： 1，浸泡时间：时间太长，外植体因农杆菌的毒害缺氧而软腐，一般不超过30分钟。 2，菌液浓度：OD600 为0.05-0.70之间。 ;5. 农杆菌与外植体的共培养 共培养: 接种后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽分化的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切面也增殖生长，这二者共培养的过程。 农杆菌转化时，并不侵入到植物细胞中，而是把T-DNA转移到植物细胞中，农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16小时之后的菌株才能诱发肿瘤，共培养时间必须长于16个小时。共培养时间过长，农杆菌过度生长，植物细胞受到毒害而死亡。胡萝卜一般为3天。 ;6．外植体的脱菌及选择培养 脱菌培养，即把共培养后的外植体转移到含有脱菌抗生素的培养基上，以杀死或者抑制农杆菌的生长。 常用的抗生素有： 羧苄青霉素，头孢霉素等使用浓度一般为500mg/L。 选择培养，转化的细胞和未转化的细胞生长发育存在着竞争，如果转化细胞生长不起来，转化就不能成功。因此选择培养是转基因必须的步骤。 常用的选择压力有：Km，Hyg,除草剂ppt等。? ;将根癌农杆菌菌株接入含有50 μg/L的Km的