大黄鱼生长激素基因的分析及其在大肠杆菌中的表达研究.pdf

Y672487 大黄鱼生长激素基因的分析及其在大肠杆菌中的表达 摘 要 为了解决目前大黄鱼 (Pseudosciaenacrocea,PC)等名贵经济鱼类在养殖 中存在的养殖周期长，饵料利用率低，养殖生产成本较高的问题，急需开发鱼类 本身的基因产物以改良鱼类养殖饲料。鱼类生长激素 (growthhormone,GH)是 鱼类脑垂体细胞分泌的多肤激素，具有增强食欲、提高饲料转化率的作用。天然 鱼GH含量极低，分离纯化成本较高。基因工程技术为生产大量低成本的鱼生长 激素创造了条件，且实验证明重组鱼GH具有天然鱼GH的功能，却不会对人体产 生激素副作用。因此，生产基因重组大黄鱼GH在养殖领域具有重要的应用价值。 本论文分析了最新克隆的pcGH基因的特征，成功实现了pcGH在大肠杆菌中 的胞内表达和周质表达，并进一步探讨了影响pcGH在大肠杆菌中表达水平的各 种因素。 通过与数据库中同类蛋白序列的比较，发现最新克隆的pcGH分别在不同位 置与数据库中的pcGH及黑斑红妒 (Sciaernopsocellata)GH有高度同源性，推 断这个pcGH基因来源于多个近源鱼种的杂交体。这一发现将有助于进一步研究 分析鱼类GH的活性部位及其突变对鱼类生长的影响。 通过PCR引物设计，在pcGH基因两端引入两个酶切位点，将其插入到大肠 杆菌表达载体 PET-22b(+)中，构建胞内表达质粒pG2.将pG2转化大肠杆菌 BL21(DE3)和Rosetta(DE3)。SDS分析发现，pG2/Rosetta(DE3)在诱导后对 应于pcGH分子量的位置有特异蛋白带随时间增浓，但在pG2/BL21(DE3)中该位 置蛋白带浓度变化不明显。说明了Rosetta(DE3)菌株有助于改善pcGH中大肠杆 菌稀有密码子对表达水平的影响。pcGH2/Roseta(DE3)的表达产物为可溶性蛋白 该产物用硫酸钱分级沉降和阳离子交换层析分离纯化，达到电泳纯。 通过酶切位点的选择，使pcGH基因插入PET-226(+)载体上pelB分泌肚编 码序列的下游 构建成功周质表达质粒pG3;将pG3转化大肠杆菌Rosett.a(DE3)， 诱导表达后分离周质蛋白，发现部分重组蛋白在周质中表达。 本文还从转录水平和翻译水平系统、完整地探讨了影响pcGH在大肠杆菌中 表达水平的各种可能因素，分析了进一步提高重组大黄鱼GH的产量的可能方法。 这些工作对重组pcGH的生产和应用具有指导意义。 关键词:大黄鱼生长激素，基因分析，大肠杆菌，胞内表达，周质表达 AnalysisofthegeneofPseudosciaena croceaGrowthHormoneandits ExpressionintheEscheri is心口方 Abstract Problemssuchaslowgrowthrateandlowconversionrateoffeedstuffexistin theculturingofPseudosciaenacroceaandothereconomicalmarinefishes.Therefore, itiseconomicallyimportanttoexploitsomegeneticproductsoffishitselftoimprove thepropertiesoffeedstuff.Fishgrowthhormone(fGH)isapolypeptideproducedby thepituitarycellsofteleosts.Ithasthecapacitytoenhancetheappetiteandfeed conversionefficiency.However,thecontentofnativefGHinpituitaryisextremely lowandtheexpenditureofpurificationistoohigh.Fortunately,itispossibleto producerecombinantfGHsabundantly.Andtheyhavebeenprovedinmanycasesthe samefunctionasthenativeoneswithouta