Genomics第5章.pptVIP

（3）三种方法用来进一步筛选酵母基因： ① 比较基因组学 ② 通过对cDNA进行测序寻找转录的证据，包括表达序列标签的文库。 ③ 转座子标记：正如可用来通过失活基因进行功能分析一样，也用来鉴定真正基因的ORF。 运用转座子标签技术鉴定酵母基因 利用含有lacZ基因拷贝的转座子，lacZ基因缺少起始密码子，这样在正常细胞中lacZ基因是失活的，因此当运用X-gal测试时，克隆就是白色。如果转座子将lacZ基因转座到一个真正酵母基因内部，并且引起酵母基因的密码子与lacZ基因的密码子按正确可读框融合的话，lacZ基因就会被激活，此时克隆是蓝色。 这些实验正在进行中，但到目前为止它们的结果将酵母基因的种类减到大约6120个ORF。这些减缩主要是对许多最初的单一孤儿进行减少得到的，但也有少数几个长度小于100个密码子的ORF被证明是真正基因而被补进来。 5.3.2 确定酵母基因的功能 酿酒酵母具有两大特征可以帮助确定未知基因的功能。这两种方法都被研究人员广泛运用 ① 具有高的同源重组的自然倾向，这就比较容易运用该方法来失活单个基因。 ② 基因组中存在转座子Ty家族，这能够将转座子标记技术用作基因失活的另一种方法。 RNAi最初在秀丽隐杆线虫中表明是有效的，预测的19000个基因都通过RNA干扰被逐个失活。 RNAi实验的关键步骤是将双链RNA导入受试生物体中。 - 对于线虫来讲，可通过喂养的方法。线虫可以吃细菌。如果细菌包含一个克隆基因，该基因能指导与线虫基因序列相同的双链RNA的表达，那么RNAi就开始运作。 - 另一种方法是可以将双链RNA直接注射到线虫中，但更费时。 已经知道一些真核生物中天然存在RNA干扰，但把RNA干扰应用到哺乳动物细胞中却很困难，因为这些生物体会对双链RNA产生并行的反应，蛋白质合成被广泛抑制，导致细胞死亡。 通过运用长度只有21或22bp的双链RNA可以防止该问题，这一长度对特异降解靶基因是足够长了，但又太短不足以引起蛋白质合成抑制效应。 3. 基因过表达也可以用来探索功能 过表达一个基因，必须运用一种特殊类型的克隆载体。 这种载体是多拷贝的，意思是在宿主细胞内它可以复制到每个细胞40-200个拷贝。 载体必须含有高活性启动子，以便每个拷贝的待测基因能被转变成大量mRNA，再次确保合成尽可能多的蛋白质。 通过基因过表达进行功能分析 目的是确定被研究的基因过表达是否影响转基因小鼠的表型。因此将目的基因的cDNA插入到带有高活性启动子序列的克隆载体上，此启动子指导克隆基因在小鼠肝脏中表达。应用cDNA而不用基因组拷贝是因为前者不含有内含子，因而比较短更易于在试管中操作。 3. 基因失活或过表达对表型的影响可能很难辨别 基因失活或过表达实验的关键之处是需要鉴别表型改变，这比听起来要困难得多。 （1）对于任何生物体，必须检查的表型范围是很广的，对表型全面评价是很困难的。 筛查酿酒酵母或秀丽隐杆线虫基因时评定出的典型表型 （2）更何况基因失活的影响可能很细微，检查表型时可能识别不出来。 典型的例子是，酵母染色体Ⅲ上最长的基因有2167个密码子，该基因失活没有明显效应，突变的酵母细胞看上去和正常酵母一样。有一段时间认为该基因是非必需的，其行使不重要的功能，或其功能可由另一个基因代替。 最后发现突变株在含有葡萄糖和乙酸的低pH环境中生长时就会死亡，而正常酵母就能耐受。因此，可断定此基因编码的蛋白质可以把乙酸盐泵出细胞外保护酵母不受乙酸引起的损伤，但很难从表型检查中被发现。 酵母5000个失活基因中有许多基因的失活对细胞在正常条件下的代谢性质不会引起可检测到的效应。 秀丽隐杆线虫，大规模的基因失活计划到目前为止只在不到10%的基因中发现到表型变化。 这暗示出大部分基因都发挥着特殊的作用，鉴别出每个基因的功能将会是一个长期而艰难的过程。 5.2.3 未知基因编码蛋白质活性的详细研究 基因失活和过表达是基因组学中探索新基因功能的基本技术，但这不是能提供基因活性信息的唯一方法。其他方法可以补充和详细说明基因失活和过表达的实验结果。 1. 定点诱变可以用来详细探索基因的功能 基因失活和过表达可以确定基因的大致功能，但它们不能提供基因编码蛋白质的详细功能信息。如，一个基因的部分序列编码的氨基酸序列可以指导其蛋白质产物定位于细胞内的特定区室，或者负责蛋白质能够对化学或物理信号产生反应。 为了确定蛋白质不同部分的功能，对基因序列的相关部位进行缺失或改变是必需的，但要使大部分序列不被改变以便仍可合成蛋白质并保留其主要活性。 可以使用定点诱变方法进行这种细微改变。。定点诱变会准确改变编码感兴趣蛋白质的基因的核苷酸序列，这些方法能够检测蛋白质不同部分的功能。 两步基因替换法 首先用标记基因来