含临床病毒株聚合酶逆转录酶区的乙肝病毒DNA稳定复制细胞系的构建研究.pdfVIP

中 国 医 学 科 学 院学 报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE · 论 著 · 含临床病毒株聚合酶逆转录酶区的乙肝病毒 DNA 稳定复制细胞系的构建 向明确 ，蔡雪飞 ，张文露 ，黄爱龙 ，胡接力 重庆医科大学 重庆市第九人民医院感染科 ，重庆400700 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆400016 通信作者：胡接力 电话：023电子邮件：hujieli1977@163．COB 摘要 ：目的 构建含有临床病毒株聚合酶逆转录酶 (RT)区的乙肝病毒 (HBV)DNA稳定复制细胞系。方法 采用巢式PCR从患者血清扩增HBVDNA片段，利用片段置换反应将该片段克隆到HBVDNA复制载体，并在该载体上 引入新霉素抗性基因，在确认该重组DNA体外可复制后，将其转染 HepG2细胞，G418筛选，采用rea1．timePCR结合 ELISA及Southernblot检测初筛和鉴定HBVDNA稳定复制细胞系。结果 从患者血清扩增出的HBVDNA片段nt55— 1654被成功置换到HBV复制质粒pLL相应区域，得到质粒pl1；新霉素抗性基因表达片段被克隆到pl1中HBVDNA下 游，获得质粒pl1一nee，Southernblot检测证实pl1一neo可支持体外复制；pl1一neo转染 HepG2后，经筛选鉴定，获得了 可支持HBVDNA稳定复制的细胞系3-10。结论 建立了含有临床病毒株聚合酶 RT区的HBVDNA稳定复制细胞系， real—timePCR结合ELISA有助于HBVDNA稳定复制细胞系的快速初筛鉴定。 关键词：乙型肝炎病毒；逆转录聚合酶；复制；稳定细胞系 中图分类号：R512．62 文献标志码：A 文章编号：1000-503X(2013)01—0013—06 DOI：10．3881／j．issn．1000-503X．2013．01．003 EstablishmentofaStableCellL‘ineReplicatingHepatitisB VirusDNA Carrying theReverseTranscriptaseRegionDerivedfrom aClinicalIsolate XIANG Ming．que ，CAIXue．fei，ZHANG Wen—lu ，HUANG Ai．1ong。 HUJie．1i ， DepartmentofInfectiousDiseases，theNinthPeople’SHospital，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400700，China MinistryofEducationKeyLaboratory ofMolecularBiologyonInfectiousDiseases，ChongqingMedicalUniversity， Chongqing400016，China Correspondingauthor：HUJie-liTel：023E—mail：hujieli1977@163．coln ABSTRACT：Objective Toestablishastablecelllinethatcanr