双表达解毒酶基因工程菌高密度培养的研讨.pdfVIP

142 农药与环境安全国际会议论文集 双表达解毒酶基因工程菌 高密度培养的研究 郭成君1’2 郑玉芝1 郭新民2 乔传令¨ (1中国科学院动物研究所农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室， 北京100080；2中国人民大学环境学院，北京100872) 摘 要 在5L搅拌发酵罐上，对一株重组双表达解毒酶基因工程菌进行了发酵工程研究。分 析了发酵过程中pH、溶解氧、细胞密度、菌体得率、蛋白含量及酶活随时间的变化规律，确定了最佳 发酵时间18h，温度20。C，pH7．0及葡萄糖含量5 g／L。为进一步进行高密度培养生产提供了条件。 关键词 解毒酶基因 工程菌发酵 高密度培养 大肠杆菌是应用最广泛的合成异源蛋白的原核表达系统。近几十年来的研究已使大肠杆 菌成为现代分子生物学研究中最常用的材料之一，其主要特点为：容易培养、遗传学资料丰富、 可用于基因工程的载体较为丰富L1|。基因工程菌细胞高密度培养是高表达外源蛋白的一重 要策略。随着基因工程的发展，基因工程菌培养研究也得到迅速发展。与常规低密度培养相 比，高密度高表达培养具有以下优点：1)它能够在单位时间单位体积的条件下获得更高的外源 蛋白产率，使单位体积的生产能力提高几倍甚至几十倍；2)减少设备体积，有利于保证基因工 程菌的安全性；3)对下游酶的纯化有利，能减少纯化设备和纯化步骤。高密度培养技术(High cell—density culture)能提高发酵液中菌体的密度，最终提高产物比生产率L2]。目前高密度培 养的方法很多，除固定化和补料分批培养外，还有用沉降、离心和微孔膜使细胞截流，形成细胞 环而达到高密度的方法L3J。利用基因工程菌发酵生产外源蛋白质已有不少文献报道，但通过 发酵工程研究改善双表达产物产率的研究较少。本文通过摇瓶培养确定了一株表达羧酸酯酶 B1和有机磷水解酶基因OPH基因工程菌的最佳培养温度为20℃，在此基础上，利用5L搅 拌发酵罐培养，研究了生物量、酶活、pH、溶氧、细胞密度(0D)等条件随时间的变化情况。期 望找到利用双表达载体系统高效生产外源解毒酶蛋白质的新途径。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1 菌株 携带质粒pETDuet—B1一OPH的E．coli为本实验室兰文升博士构建。 5 1．1．2发酵种子培养基蛋白胨10g／L；酵母粉5g／L；NaCIg／L；pH7．0；氨苄青霉 素50 tlg／mL。 1．1．3补料分批发酵培养基[5]蛋白胨40g／L；酵母粉20g／L；KH2PO。8g／L； 基金项目：国家“863”计划项目(2002AA601160) *通讯作者。联系电话：010E-mail：Qiaocl@ioz．ac．cn Ⅱ 农药与环境安全 143 15 0．08 NazHP04g／L；CaClz 0．4 0．8 g／L；NH4C1g／L；MgS04g／L；葡萄糖5 7．0。 g／L；pH 1．2培养方法 种子摇瓶培养：250 mL摇瓶装100mL培养基，接种量2％，30℃摇床(160r／min)培养， 12 h(制备种子)，培养基中加氨苄青霉素终浓度为50 ttg／mL以去除杂菌。 5L发酵罐分批补料培养：将补料分批发酵培养基3L装入5 L的发酵罐，121。C灭菌(葡萄 糖分装灭菌)20 min，冷却至37℃接人液体种子，接种量4％，加氨苄青霉素终浓度为50ttg／mL