反义MDR1RNA表达质粒的构建及其对宫颈癌耐药细胞的逆转作用研究.pdfVIP

二、大会报告论文 -Y}-%-( 反义MDRl-RNA表达质粒的构建及其 沙 尸 7 若 奋 7 对宫颈癌耐药细胞的逆转作用 j 夕 ︺ 门 介 卜 尸 J ‘ 北京铁路总医院 潘俊峰 周友珍 吴澄宇 子宫颈癌是发展中国家最常见的妇科恶性肿瘤之一，宫颈癌的治疗以综合治疗为主， 包括手术、放疗、化疗和生物治疗，早期宫颈癌采用综合治疗可获得满意的疗效，其5年 生存率可达80%。而对晚期 复发性宫颈癌，目前缺乏有效的治疗方法，5年生存率仅为 20-40%,影响这类病人疗效的主要因素之一，为宫颈癌组织对化疗的耐药性，肿瘤耐药 往往是其化疗失败的重要原因。 1989年Ueda等利用耐药的KB细胞成功地直接克隆了MDRI基因，它的过度表达 与肿瘤的获得性耐药有关，本文采用反义核酸技术对宫颈癌耐药细胞株的耐药性进行逆 转，试图提高宫颈癌组织对化疗药物的敏感性。 一、主要实验材料: 1,质粒 PMDR200X5:为4.38kh的人mdrlcDNA克隆在pGFM-2载体上。具有氨节青霉 素抗性，由美国国立癌症研究所倒CI)MichaclMGofcsman教授惠赠。 PDORneo逆:转录病毒载体，6.55kh，包含有M-MULV5、和3-LTR,SV40早期启 动子、一个IOhp长的含 三个单一酶切位点的多克隆区域及部分PBR322片段。具有 氨节青霉素及新霉素抗性。 PHDR5A;4.25kh，为人MDRIcDNA5A(ll78bp-2561bp)克隆在pGEM一载体上， 具有氨节青霉素入抗性。 2、大肠杆菌菌株 HBIU1M)型:supEA4mF-;hsd;s2U(rB-;mB-);re-cA13;aral4;proA2;LacYl; gaIK2;psL20(Sm);xyl-5;mtl-l;x-;适用于PBR322等的转化。 3、细胞系 KBy,.V:人C7腔上皮癌细胞耐药株，系MDRI高表达。 PDD细胞系:系人宫颈癌细胞株 (Hcla-Cell)对顺铂的耐药株，称为 PDD-Hcla- Cell,经反义核酸逆转后称为PPd-Hcla-AS-Cell. 4.P-GP单克隆抗体 MRK-16:能识别P-糖蛋白的单克隆抗体，日本癌症研究基金会肿瘤化疗中心 TakashiTsuruo教授提供。 _ 22— 5、 酶类 限制性内切酶:FcoR 1;BamHISalI,xholdt等，友谊公司BochringcrMannhcin 提供。 碱性磷酸酶:CIAP,BochringcrMaimhern,Ggermanya DNA连接酶:T4NDAligase,Boel，ingerMannhern,Ggermany提供。 核糖核酸酶:RNase,PrmcgaUSA提供。 蛋白酶K:ProteinaseK,PrmegaUSA提供。 二、实验方法 (一)质粒的构建 1质粒DNA的制备 (略) 2.目的DNA片段的分离与纯化:采用DEAE纤维素插片电泳法和玻璃粉末洗 脱法。 3.大肠杆菌感受态细胞的制备与转染。 4重组子的处筛选与鉴定 (二)细胞培养 (三)细胞的转染 (四)基因DNA的制备 (五)细胞RNA的提取 (六)Southern杂交 LDNA的酶解、电泳与转腹 取long基因组DNA经内切酶消化过夜后，于。8%琼脂糖胶中电泳(2-3vhm, 12-14小时)。将胶于。.2MHCL中浸泡2次，每次10分钟，再用变性液(L5MNacl, 0.5MN