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实时荧光定量PCR原理及应用 张达威-技术支持 上海吉泰生物科技有限公司 主要内容 • 荧光定量PCR原理 • 荧光定量PCR 方法与应用 实时荧光定量PCR 定义：实时监测PCR扩增反应 方法：利用荧光信号 目的：估算特异性模板的初始浓度 优势： 灵敏度高 重复性好 动态范围宽 高通量 传统PCR定量 传统的PCR 定量是一种终点法的检测 ： 动态范围受限 检测重现性极差 定量不准确 低通量 不能实时得到结果 Gel-based quantification 11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference Real-time quantification Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference 传统PCR与实时定量PCR 终点检测 重复性好 精确度高 Ct 误差小 阈值与CT值 • 阈值threshold ：在荧光信号指数扩增阶段， 在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值， 一般荧光阈值的缺省设置是 3-15 个循环的 荧光信号的标准偏差的10 倍。 • CT=cycle threshold 即阈值循环数：荧光信 号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。 C(t)值与阈值 ] A N D [ 阈值threshold 检测极限 C t C C Cycle t t 扩增曲线 •平台期 e •指数扩增期 c n e c s e r •dR o •基线 u l F • •阈值 •Ct •Cycle Number 荧光定量PCR计算原理 • 起始模板浓度的对数 与C(t)值成反比 如何定量 ① 绘制标准曲线 ② 所测样本C(t)值 ③ 定量 通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品 的Ct值，依据 Log