康为20100806荧光定量PCR技术培训-.pptVIP

Real time PCR--起点检测： -- 起点量是样本中起始的DNA量 -- “加入了500个拷贝” -- 具有重现性，误差小 传统PCR--终点检测： -- 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- “生成了500，0000，0000个拷贝” -- 不恒定，误差大 Real-time qPCR 标准曲线分析 SYBR Green I 工作原理 SYBR Green I 优点： 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物 通用性好 -- 对DNA模板没有选择性 融解曲线分析 Taqman 工作原理 探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，5’ 报告基团、3’淬灭基团） 完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭， 没有荧光产生。 聚合酶的5’外切酶活性 报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。 Taqman 工作原理 SYBR Green I与Taqman 对比 Taqman 特异性高 -- 与特异靶序列结合 对模板有选择性 -- 可进行多重PCR反应 荧光定量PCR解析方法 绝对定量 样本中核酸的量（拷贝数、微克） -- 检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有6000个拷贝 相对定量 不同样本中目的基因表达量的差异 -- 肿瘤组织和正常组织相比 某个基因的表达量mRNA改变了多少倍，改变了60倍 绝对定量举例 相对定量 相对定量举例 Master mix的应用 使用Master mix有效降低系统误差 -- 热启动酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10min Fast Hotstar 抗体修饰，热复活仅需几十秒 -- Buffer 反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂 -- Dye Real SYBRGreen mix RealSuper mix 荧光定量PCR体系 误差控制 使用Master mix 配置预混体系 设置生物学重复（不同个体） 技术性重复（复孔） 阳性和阴性对照 实验环境控制 试剂准备区 核酸制备区 反应液制备区 荧光定量PCR反应区 双标准曲线法 实 验 流 程 Company name  SYBR Green法实验流程 Company name 样本处理 RNA提取 qPCR 数据分析 逆转录 样本处理与RNA提取 外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ RT-PCR一步法还是两步法？ 两步法: 反转录和PCR扩增分两步进行。 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检测 多个基因。便于反应优化。在工作的初期。 一步法：反转录和PCR扩增在同一管内完成。 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。在工作的成熟阶段。 总原则与普通PCR相同： 避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 - 300bp) 推荐做跨intron设计 引物设计原则 Master mix的优化 新型荧光染料(Super Green) 激发、发射波长与SYBR Green近似 对PCR反应抑制更轻微 可使用较高浓度(1uM, SYBR green 0.3uM)更亮，灵敏度更高 对小片段DNA和ssDNA结合更弱 减少背景，有效信号更强 化学性质更稳定 致突变性与毒性更弱 SYBR Green Super Green Master Mix ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 有不同系统，需参照仪器要求选择。 数据分析 融解曲线：单一特异性产物 扩增曲线： -- Ct值大小 -- 各复孔之间重复性 -- 不同浓度梯度稀释的间隔性 标准曲线： -- R2＞0.980或∣ r ∣ ＞0.990 -- 反应效率尽可能高：90%-110% -- 目的基因的