色谱柱是HPLC分离过程的核心一支稳定.docVIP

第5章 色谱柱 5-1引言 色谱柱是HPLC分离过程的核心。一支稳定、高效的色谱柱对建立普适性强、重现性好的方法是必不可少的。不同供应商的色谱柱，甚至来源相同、认为完全一样的色谱柱之间，可能也会存在很大差异，尤其是不同的色谱柱在塔板数、谱峰的对称性、保留值、峰间距以及使用寿命方面会有所不同，而这些不同对建立理想的HPLC方法会产生很大影响。本章中，我们将提供一些有关色谱柱担体、固定相及柱填料的信息供读者参考；讨论色谱柱应用中的问题，以及适宜的解决方案，以确保方法普适性强、重现性好，同时也讨论了在常规HPLC分析中，为获得最佳结果，一支“好”色谱柱的重要意义。 选择HPLC柱时，大多数使用者都认为柱间的重现性是方法建立中极为重要的因素。色谱工作者不愿在校准了一具体系统后，又不得不为一新色谱柱再重新建立HPLC方法。一些生产厂能在一定程度上保证柱性能指标的重现性，如色谱柱塔板数（N），特定样品与条件下的选择性，反压（压力降），特定测试溶质的保留值（k）。因此，对许多使用者来说，生产优质产品的厂家的信誉很重要。价格对一些用户是重要的因素，但上述讨论的其它因素在建立一个普适性强、令人满意的方法时往往更加重要。色谱柱价格在建立和应用普适性强、可靠的HPLC方法的整个费用中，仅占一小部分（见5-3节）。 5-2色谱柱与柱填料的特性 5-2-1柱填料 大多数用于HPLC分离的柱填料使用硅胶微粒（作担体）。基于多孔聚会物担体或其它材料的色谱柱也已商品化，这些非硅胶填料由于有其特殊的应用，以后再作讨论。由于硅胶担体与键合的有机表层（如C18或C8），应用范围广，我们将作重点讨论。 图5-1所示为HPLC中常用的几种微粒类型。由于全多孔微球很好地兼顾了众多理想的性质：效能、样品荷载量、耐久性、方便性以及有效利用率等，所以最为常用。这些微粒有不同的粒径、孔径和表面积供选择，所以用这些物质能建立各类HPLC方法。 图5-1的微粒类型（图示大致为所用微粒的相对大小）。 实心微球型微粒固定相有一实芯核，起作用的是其表面很薄的外壳。这些硅胶或聚会物基质的微粒，通常为1.5~2.5μm，因为其快速传质的动力学过程，对大分子有突出的福利效能。因为这些实心超小微粒的表面积较小，样品容量有限，所以仅适于分析型HPLC。这种超小微粒的色谱柱出峰极为尖锐（小体积），因此要求所用HPLC仪器的柱外峰展宽因素极小，以避免峰展宽。 灌注色谱填料包含孔径达4000~8000A0（艾）的贯穿孔，而且在这些贯穿孔网络中还有较小的内联孔（如300~1000A0（艾））。在高流速时，溶质可通过对流和扩散的共同作用，进入（并离开）该孔结构。其效果减少了峰展宽，所以大的多孔微粒在柱效方面与小微粒相当，但压力降却小得多。目前这种类型填料的使用还较少，因此，其实用性还有待于进一步探讨。不过，这种填料似乎非常适于大分子如蛋白质的制备分离，用于小分子的日常分析分离则较少。 颗粒大小（粒度）在HPLC中极为重要。约5μm的微粒直径很好地兼顾了分析柱的柱效、反压和寿命。更小的多孔微粒（如3μm）对快速分离很有用。小至1.5μm的薄壳微粒对极快速地分离蛋白质等大分子较有用。较窄的粒度分布（±50%均值）能保证填充床的稳定、高效和压力降最小。总的说来，3或5μm全多孔微球填充HPLC色谱柱，能满足大多数分离的需要，我们推荐大多数的方法建立用这些粒度的色谱柱。 表5-1总结了HPLC分离用微粒的理想的物理特性，以及它们的重要性。一般使用7~12nm（70~120 A0（艾））孔径的全多孔微粒。表面积150~400m2/g的全多孔微粒分离小分子较有利。表5-2列出一些窄孔径C18商品柱的典型物理性质。对于分子量大于10000Da分子的分离，需用孔径大于15nm的微粒，使这些溶质容易进入到微孔结构内部的活性表面。各种情况下，都应保证溶质在微孔里能迅速扩散与柱效良好。孔径至少是溶质流体动力学直径的4倍，才能确保溶质的有限扩散不至于使柱效下降。大孔微粒的比表面积有10~150m2/g不等，取决于微孔直径的大小；孔径越大表面积越小。 表5-2 分析柱的理想的微粒特性 特性 用途 5μm全多孔微粒 大多数分离 3μm全多孔微粒 快速分离 1.5μm薄壳微粒 极快速分离（尤其是大分子） ±50%（均值的）粒径分布 稳定、重现、高柱效、柱压低 7~12nm孔径，150~400m2/g（小孔） 小分子分离 15~100nm孔径，10~150m2/g（小孔） 大分子分离 表5-2 一些C18色谱柱硅胶担体的物理性质 色谱柱 孔直径（nm） 表面积（m2/g） 体积孔隙率% （ml/ ml） Hypersil ODS 12 170 57 LiChrosorb C18 10 355 71 Novapak