抗噬菌体菌株的选育.ppt

第五节 原生质体融合技术 （protoplast fusion） 概念： 把两亲本细胞壁酶解，在高渗环境中释放出球状体（原生质体），混合原生质体，由聚乙二醇(PEG)作助融剂，使互相凝集、融合，两亲本基因组由接触到交换，实现遗传重组。 ① 、不需要有已知的遗传系统。 去除了细胞壁，亲株基因组直接融合、重组，不需要有已知的遗传系统。 （一）原生质体融合的优越性 ②、得到多种类型的重组子 原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，得到多种类型的重组子。 参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这是一般常规杂交所达不到的。 ③ 、重组频率特别高。 因有聚乙二醇作助融剂。如天蓝色链霉菌种内重组频率可达到20％。 ④ 、可以和其他育种方法相结合。 把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。 ⑤ 、易于提高筛选效率。 可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后融合，在再生菌落中筛选重组子。这样可提高筛选效率。 （二） 原生质体融合的一般步骤 原生质体融合方法： PEG促溶、电诱导促融等。 ① 、细胞经过原生质体化与再生，常伴着基因突变，可能得到高产变异菌株。 例1：生二素链霉菌通过原生质体再生使螺旋霉素产量提高2倍。 例2：弗氏链霉菌通过再生使泰乐菌素生产能力提高了3倍多。 （三） 原生质体融合在微生物育种中的应用 ② 、链霉菌经过原生质体化，再生成细胞时，常引起质粒消除，导致染色体或次级代谢途径变化，可能出现高产变异株。 质粒消除频率达13％～85％， ③、种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。 ④、 有效的种间融合，可能使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发“沉默基因”的表达，产生新物质。种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。 第六节 DNA重组技术 （DNA recombination） 概念： 按人的意志，将供体遗传信息在体外与载体相接成重组DNA分子，然后转入受体细胞中，使其在受体中表达和遗传。 工业应用举例： 将血红蛋白基因引入顶头孢霉菌中，限氧条件下头孢菌素C的产量提高了5倍； 将麦迪霉素产生菌的4’-羟基酰化酶基因克隆到生二素链霉菌内，可直接产生酰化螺旋霉素。 医药应用举例： ①、人胰岛素、干扰素、人白细胞介素、人促红细胞生成素(EPO)、重组链激酶和集落生长因子等。 ②、基因工程抗体，极大地拓展了抗体的功能及其临床应用范围，可用于肿瘤、病毒病治疗等。 ③、转基因动物，生产一些需要量大或Pr复杂需要翻译后修饰的重组蛋白. DNA重组在育种方面的优势： ① 、增加生物合成基因量，增加抗生素产量； ② 、导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量； ③ 、把两种不同的生物合成基因在体外重组后导入受体内产生杂交抗生素； ④、 激活沉默基因，产生新的生物活性物质或提高抗生素产量； ⑤ 、把异源基因克隆到宿主中表达，改变生产工艺。 （一） DNA重组技术基本过程 工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约基因工程转变为生产力的关键之一。 （二） 工程菌的稳定性 外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。 本质：质粒不稳定；表达产物不稳定。 内在表现：质粒丢失；重组质粒DNA片段脱落。 1、 工程菌不稳定性的表现 质粒丢失： 由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。 重组质粒上一部分片段脱落： 表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。 表达产物不稳定： 人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。 影响工程菌稳定性的因素： （1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等。 （2）宿主：质粒中有同源序列，宿主的比生长速率、宿主中重组基因的完整性、重组时有关基因的变异等。 （3）环境因素：高温、去垢剂、某些药物