考马斯亮蓝法测蛋白质含量精选.pptVIP

实验四：考马斯亮蓝法测定 蛋白质含量 制作: 医学与生命科学学院生技二班 一、实验目的。 ⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。 ⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。 双缩脲法和Folin—酚试剂法的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 二、实验原理 ★考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 ★在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比 ★实验优点 （1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 ★实验缺点 （1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 三、实验器材与试剂 ⒈器材。 可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚轴。 ⒉试剂。 ⑴0.9％生理盐水 ⑵考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至 1000ml，存于棕色瓶。 ⑶蛋白质标准溶液 准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置1000μg/ml标准溶液。 四、实验步骤 ㈠标准曲线的制作 取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。 ㈡样品提取液中蛋白质含量的测定 注意：本次实验不用小麦叶片提取蛋白，直接用实验室提取好的蛋白液，因此直接进行下一步。 ㈢结果计算 样品蛋白质含量=———————— ﹙μg／g鲜重﹚ m为从标准曲线查得的蛋白质含量。 ㈣、标准比较法 取三只试管，按下表操作 ★样品蛋白质提取液含量m(μg)=Au／As×100 五、注意事项 ⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100~800μg／ml为宜。 ⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面，对后续测定造成影响，因此测定结束后用无水乙醇清洗比色皿。 * * 考马斯亮蓝法出现背景 100 80 60 40 20 0 Ρ(蛋白质含量）／（μg／0.1ml) 0 20 40 60 80 100 V(0.9％生理盐水）／μl 100 80 60 40 20 0 V（标准蛋白溶液）／μl 6 5 4 3 2 1 试管编号 试剂 每支试管加入3ml考马斯亮蓝试剂 振荡混合后放置5分钟 于595nm测定吸光度 A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标 绘制标准曲线 取3支试管，各吸蛋白提 取液0.1ml，分别加考 马斯亮蓝试剂3ml 振荡混合放置5分钟 以制作标准曲线的1号试管 做空白对照，595nm测吸光度 据所测A595值，于标准曲线 上查出相当标准蛋白的量，取 三重复样品蛋白含量均值 m (μg) ×提取液总体积（ml） 所取提取液体积×样品鲜重（ 调零 A595 3.0 3.0 混匀放5min 3.0 V（考马斯亮蓝试剂）／㏕ 0.1 __ — V(0.9％生理盐水）／ml 0.1 — V（蛋白质标准液)ml __ __ 0.1 V(样品提取液）／ml 对照管（B) 标准管（S) 待测管（U) 试管编号 试剂