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生物分离工程 （四） 沉 析；沉淀Precipitation；sedimentation 沉 析 利用沉析剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 特点：操作简单、经济、浓缩倍数高 种类：盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 一般沉析操作的过程 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 沉淀物的陈化，促进晶体生长； 离心或过滤，收集沉淀物； 分离特点 (1) 料液体积大大降低 (2) 作为纯化前处理或最 后产物 收集方法 (3) 操作简便 蛋白质的溶解特性 蛋白质胶体溶液的稳定性 静电斥力 吸引力 盐析(Salt induced precipitation) 在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： 两性电解质，由于静电力的作用，分子 间相互排斥，形成稳定的分散系蛋白质 周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子， 避免了相互碰撞 蛋白质盐析 机理： （1）破坏水化膜， （2）中和电荷 盐析经验式 盐溶 盐析 饱和度 中性盐的盐析效果 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀 离子强度对盐析过程的影响 Cohn经验公式 S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价 β，Ks—常数 盐析经验式 β和Ks的物理意义 β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。 用盐析分离蛋白质方法 Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析； 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 改进的蛋白质溶解度方程 选用盐析用盐的几点考虑 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为： 半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 （Ks）磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁 阴阳离子盐析效果 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 硫酸铵： （1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。 常用的盐析用盐 硫酸铵：溶解度大（767g/L） 硫酸钠 磷酸盐 柠檬酸盐 盐析用盐的用量选择 饱和度的概念： 以硫酸铵为例： 250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L 定义为100%饱和度 因此，如果我们说，沉淀某一种蛋白质需要60%饱和度的硫酸铵，那么需要硫酸铵固体的量是多少？ 影响盐析的因素 溶质种类的影响：Ks和β值 溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高； pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近； 盐析温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降 pH值和温度的影响 β随pH 变化 （1）对数关系 （2） 等电点附近有极小值 β随温度变化 随温度升高减小，热促失水膜 盐析注意事项： (1) 稳定pH 用磷酸缓冲液 （2）硫酸铵加入后体积变大 （3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度 工业化生产的选择 1.注重纯度的选择 2.注重产量的选择 3.即注重纯度又注重产量的选择 有机溶剂沉淀 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。 有机溶剂沉淀法 机理； a 介电常数 b 溶剂化（蛋白质结合水被取代） c