抗AIV H9亚型独特型单克隆抗体的研制研究.pdfVIP

2004学术年会 抗AIV H9亚型独特型单克隆抗体的研制 彭军，李宝全，牛钟相 山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018 该血清提纯得到免疫球蛋白IgG。用该IgG制备疫苗免疫sPFBALB／c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨 髓瘤细胞NS一1融合，采用间接酶联免疫吸附试验检测杂交细胞培养上清液，筛选获得3株特异性 验表明，该单克隆抗体仅与相应的鸡抗AIV H9N2亚型独特型抗体血清发生特异性反应，而不能与 AIV在MDCK细胞上进行中和实验，表明鸡抗该单克隆抗体血清的中和效价较高。 关键词：禽流感病毒；单克隆抗体；酶联免疫吸附实验；中和试验 禽流感(Avian 病，被国际兽疫局动物流行病组织(OIE)列为A类传染病。1878年在意大利首先发现，随后在欧 洲、美国、东南亚、日本、南美和俄罗斯也相继发生，现在几乎已遍布世界各地。近年来，高致病 性禽流感在亚洲的泰国、越南等国暴发流行，给养鸡业造成了巨大的威胁；同时发生人类的感染、 死亡，引起了世界各国政府和学者的高度重视。 禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科的A型流感病毒，囊膜上有含血凝素(HA)和神经氨酸酶 (NA)活性的糖蛋白纤突。禽流感病毒不稳定，易发生抗原变异，称为“漂移”。若同一宿主同时 感染两种同一型流感病毒，就有可能发生基因重排，导致不同毒株HA和NA的交换，从而可产生 高度致病性的病毒株。 目前，世界范围内防治禽流感的对策是对发病禽进行封锁、扑杀，对未感染禽群进行疫苗免疫。 当前预防禽流感用的疫苗主要是灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、重组活载体疫苗和核酸疫苗。灭 活全病毒疫苗是普遍使用的疫苗，一般用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚尿囊增殖液，辅以佐剂，实验证明 有良好的免疫保护作用。但是在疫苗的生产及使用过程中存在着严重的散毒和弱化毒株返强危险， 这也正是OIE规定禁止使用AIV毒株疫苗的原因。 抗独特型抗体疫苗可以很好的解决以上问题，经初步实验，该种疫苗防制禽流感效果显著。本 研究制备的抗AIV H9N2亚型独特型单克隆抗体，可以为进一步研究抗独特型抗体疫苗及其实践应 用提供科学依据，同时为控制禽流感的发生及流行提供技术保证。 1材料与方法 1．1材料 医学科学院惠赠；SPFBALB／e小鼠，购自山东大学实验动物中心；SPF鸡，购自山东省农科院家禽 研究所SPF鸡场。 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)第二抗体、兔抗鸡IgG第二抗体，购自北京鼎国生物 2004学术年会 技术有限公司产品。 Medium ．ribofuranosyl]一5一methyl—uracil)，购自SIGMA公司产品；RPMI 司产品：OPD，S为SIGMA公司产品。 1．2 方法 BAL l。2．1免疫原的制备及SPFB／e小鼠免疫 标准AIVH9N2亚型毒株接种SPF鸡胚，将收获的尿囊液经差速离心和蔗糖密度梯度超速离心 后得到纯化的抗原。 用该抗原制成油佐剂灭活疫苗，免疫SPF鸡，收集高免血清。用(NH4)：S04盐析法提取血清 中的免疫球蛋白(IgG)，并且用分光光度计测定IgG的浓度(c)为4．090mg／ml。 用以上提取的鸡抗AIV(H9N2)IgG作为免疫原，制备弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂疫苗免疫 6～8周龄清洁级雌性SPFBALB／c小鼠。首免用弗氏完全佐剂疫苗背部皮下多点注射；间隔10天后 用弗氏不完全佐剂疫苗作第二次、第三次免疫，方法同前。融合前3天用IgG腹腔加强免疫一次。 1．2．2杂交瘤细胞的融合 下培养。 1．22 BAL 2饲养细胞：无菌取出未免疫SPF B／c小鼠的脾细胞和巨噬细胞，计数，制成融合、筛 选使用的饲养细胞悬液。 BAL 1．2．2．3脾细胞：无菌取出免疫SPF B／c小鼠的脾脏，研磨、离心，重悬，计数，制成完全培 养基脾细胞悬