抗AsiaⅠ型口蹄疫单克隆抗体的制备及初步应用研究.pdfVIP

772 2006学术年会 抗Asia I型口蹄疫单克隆抗体的 制备及初步应用。 张怀宇卅 王泰健1 赵耘1 支海兵1 袁新宇2 马军武3 陈九连4赵启祖1 (1．中国兽医药品监察所北京100081；2．中牧股份兰州生物药厂甘肃兰州730046； 3．中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730096； 4．金宇集团生物药厂 内蒙古呼和浩特010030) 摘要：通过蔗糖密度梯度离心纯化AsiaI型(新疆毒株)口蹄疫146s灭活抗原，3次免疫Balb／c系小鼠后，取小鼠的脾 细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行融合，采用间接夹心ELISA的筛选方法，共筛选出5株分泌抗AsiaI型口蹄疫病毒单克隆抗体 的杂交瘤细胞，其中1’qQ、8。bCIo、10。G 定各株腹水的效价分别为1’G3Q为l：10，485，760；2。G马为l：20，971，520；8。b Q blotting结果表明，l。G3Q、2。龟玛，、8。Bclo为构象型表位，10’QGl为线性表住；并初步应用这几株单抗建立口蹄疫抗原 ELISA检测方法，探索用ELISA方法测定成品口蹄疫灭活疫苗的有效抗原含量的可行性。 关键词：Asia I型(新疆毒株)口蹄疫146s灭活抗原；单克隆抗体；间接F_LISA。 口蹄疫(foot—and—mouthdisease，肿)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物 要畜种及其他家养和其他野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。目前，我国对口蹄疫主要采用疫苗预防为 主的策略，口蹄疫疫苗的质量是保证控制措施实施的重点。本研究制备亚洲1型口蹄疫单克隆抗体的主要 目的是利用单克隆抗体的特异性建立一种替代本动物攻毒实验测定口蹄疫疫苗效力的体外实验方法。目 前．已初步确定了所建立的方法在测定口蹄疫疫苗总抗原含量方面有着良好的特异性和线性相关。 1 材料 1．1抗原及毒株 Asia I型口蹄疫浓 I型(新疆毒株)口蹄疫疫苗灭活抗原液，由金宇集团内蒙古生物制品厂提供；Asia I型口蹄疫病毒(保山毒由中牧兰州生物制品厂提供)。 缩标准抗原，由兰州兽医研究所提供；Asia 1．2细胞 SP2／0骨髓瘤细胞，由本所保存；BHK21细胞，由中牧兰州生物制品厂提供。 1．3实验动物 Balb／c系(SPF级)8周龄雌性小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 1．4血清 抗Asia I型FMDV阳性鼠血清以及 亚类标准血清，购自Sigma公司；胎牛血清和小牛血清，购自Hyclone公司；Asia ·通讯作者：赵启祖，研究员，主要从事口蹄疫防控技术研究。 一作者简介：张怀宇(1981一)，男，内蒙古乌兰察布人，在读研究生。兽医微生物免疫与生物制品方向。 兽医部分 773 对照小鼠血清，由本课题组自制。 2方法 2．1抗原的提取与纯化 取5000mlAsia 7．6)，然后静 45000r／min，3h，4。C，离心结束后，弃掉上清液，在管底沉淀处加一定体积的TNE缓冲液(pH 7．6)洗下管内沉淀，使用超声波来冲开团集在一起的大颗 置过夜。然后，用一定体积的TNE缓冲液(pH 粒，再加入1％比例的浓度为10％的NonidetP一40，然后振荡混匀．在台式离心机上，12000r／rain，离心 lmin，上清液即可上样。 预先用TNE缓冲液(pH7．6)配制好15％、25％、35％、45％的蔗糖溶液，然后做好蔗糖密度梯度。加 光度计在259nm处测定蛋白含量，取第二个蛋白吸收峰处的液体，计算蛋白含量，然后放一700C保存备 用。 2．2小鼠