抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性研究.pdfVIP

家禽传染瘸 生学意义．疫苗的免疫对控制禽流感流行、减少经济损失有很大作用，但疫苗免疫会干扰禽流感的诊断， 常规的实验方法无法区分野毒感染和疫凿免疫的禽群，从而掩盖了禽流感的流行，增加AI防制的难度， 而且还严重影响到贸易出口。我们用NSl蛋白作为一种鉴别诊断标记，建立了检测NSl抗体的ELISA试验． 区分野毒感染和灭活疫苗免疫，做到对感染的禽群早发现、早诊断、早消灭，在当前有重大的现实意义。 3_3研究中发现，本实验存在一定的菲特异性反应，这可能与抗原纯度及生物活性有关。 O．149。因此为克服非特异性，进一步采用亲和层析等方法纯化表达的蛋白十分必要。另外．常规的灭活疫 苗都采用鸡胚尿液生产，因病毒的复制也会在鸡胚液中存在少最NSl蛋白．但Tumpey等的研究表明当血 清的稀释倍数为l：200可克服非特异性反应。本实验研究的结果与Tumpey等报道的一致，非特异性反应 随着血清倍数的增加而减小，当血清1：200倍稀释时最佳。为了进一步降低试验的非特异性，Tumpey等还 低，这提示我们．可以利用人工台成小肽作为ELISA包被抗原，也可以区分野毒感染鸡群和疫苗免疫鸡群。 参考文献昭 抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性 李娜，泰爱建·，邵红霞，金文杰，刘岳龙 (扬州大学’江苏省动物预防医学重点实验室，扬州225009) 细胞进行融合，采用间接免疫荧光试验(IFA)方法检测阳性克隆．经有限稀释法亚克隆。建立杂交瘤细 800～25 染性法氏囊病毒(IBDV)反应。单抗的腹水IFA效价l：12 用结果显示，用这些单克隆抗体建立的免疫荧光或ELISA方法可以迅速检测出禽流感病毒，这些单抗在禽 流感的预防监测中将有十分重要的应用前景。 关键词禽流感病毒 核蛋白单克隆抗体 间接免疫荧光ELISA 禽流惑(Avian 根据禽流感病毒对家禽所造成的危害程度，将禽流感分为高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感 外对禽流感的控制展开了广泛深入的探索，我国在2004年对外宣布禽流感并迅速扑灭后．许多学者在禽流 感的监控上进行了研究．目前用于禽流感监测的方法有病毒分离、中和试验、琼脂扩散、血凝和血凝抑制 试验，RT-PCR等．这些方法虽然均可以用于病原的诊断，但这些方法或是试验周期长．或是对实验设备有 特殊要求，有的还需要专门的技术人员，难以胜任对禽流感爆发时的快速诊断。我们以杂交瘤技术研制抗 禽流感病毒共同抗原的特异单克隆抗体，旨在建立一种双抗体夹IC,ELISA方法快速检测流感病毒，以便为 A型流感病毒的快速诊断技术的研究提供条件。现报道如下。 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 1材料与方法 1．1材料 法自行制备。 1．2方法 1．2．1免疫原的制备H9亚型禽流感病毒按一定比例稀释后接种9～10日龄非免疫鸡胚，37℃孵育。 关器皿和液体均进行无害化消毒处理。 免疫1次，三免后小鼠眼静脉丛采血，测抗体效价。融合前3d再加强免疫1次。细胞融合按常规方法进行181。 1．2．3免疫荧光方法检测采用间接免疫荧光试验(IFA)检测杂交瘤细胞培养上清，按文献报道的 方法进行嗍。主要步骤是，禽流感病毒感染96孔培养板中单层成纤维细胞(CEF)，当细胞出现病变时．吸 亮绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。 1．2．4 鼠腹部已经明显膨大时，收取腹水，5000rpm离，t：,10min，吸取上清，分装，．20℃冻存备用。 1．2．5单抗的特异性鉴定 述IFA方法进行检测，同时设置阴性和阳性对照，测定抗禽流感-NP单克隆抗体的免疫学特异性。 1．2．6 000 Western-blotting试验将AIV_H9、SPF尿囊液抗原5 进行浓缩，然后加入等体积的2倍上样缓冲液．混匀，煮沸10 的上样样本，然后进行SDS—PAGE分析，并按文献p1的方法将蛋白质抗原转印到硝酸纤维素膜(NC)上， 进行Western．blotting分析。 检测单抗的亚类，按产品说明书进行，主要步骤是取杂交瘤细胞培养上清，在标准酶标板上依次加入标准 HRP标记的羊抗鼠IgC(Fabspecific