抗CMV和ToMV双价核酶基因的设计与克隆研究.pdfVIP

摘要 黄瓜花叶病毒 (cucumbermosaicviurs,CMV)和番茄花叶病毒 (tomato mosaicviurs,ToMV)是我国当前番茄 (Lycopersicon二“lentum)生产上两种 最主要的病毒。但是，目前尚未见获得兼抗CMV和TOMV的转基因植株的 报道。本研究探索应用核酶策略来防治番茄上这两种病毒病。选择CMV和 TOMV广东分离物的复制酶RNA作为核酶作用的靶分子，分别设计锤头型核 酶。根据GenBank中已经报道的株系的序列，利用RNA二级结构分析软件 预测其复制酶RNA的二级结构。从二级结构图中找出二级结构较松散的区 域，进而依据该区域设计PCR引物以扩增部分复制酶基因，使该部分复制酶 基因RNA适合作为核酶作用的靶标区。 以分别接种有CMV和TOW 广东优势株系的普通烟为植物材料抽提总 RNA，以抽提的总RNA作模板进行RTPCR扩增。将扩增产物插入到RNA 表达载体pGEM-3Z的多克隆位点，构建核酶作用底物的体外转录表达载体 pG-C-RP和pG-TRP,筛选阳性克隆进行序列分析。将序列测定结果与 GenBank中己经报道的株系作同源性分析，结果显示所克隆的片段与CMVK 株系和TOMV浙江分离物同源区段的同源率分别为95.67%和100%. 依据锤头型核酶设计原理在保守区域中寻找一个核酶的最佳作用位点 GUC，进而分别设计核酶C-RZ和TRZoC-RZ和TRZ选择的GUC位点分 别为其复制酶RNA的200-202nt和328-330nt处。两个单价核酶长都为44nto 由核酶的序列推导出核酶基因序列，再根据核酶的基因序列设计核酶基因引 物，引物的3端互补配对。采用PCR法和T4DNA聚合酶法合成核酶基因， 再将两个单价核酶基因连接起来构成双价核酶基因。分别构建单价核酶体外 转录表达载体pG-C-RZ,pG-TRZ和双价核酶体外转录表达载体pG-TC-RZ. 重组质粒酶切鉴定和序列分析结果表明单价核酶基因和双价核酶基因都按设 计要求插入到RNA表达载体的多克隆位点中。 为检测所构建的核酶及其底物的体外转录表达载体是否能够转录以及设 计核酶活性的强弱，特进行体外转录与切割试验。首先抽提核酶及其底物的 体外转录表达载体的质粒，纯化后用位于T7启动子和插入片段下游的特定的 限制性内切酶酶切线性化，从而使转录在特定的位点结束。以线性化的质粒 为转录模板，用T7RNA聚合酶进行体外转录，使转录按照设计要求在特定 的位点起始和结束，获得一定大小的转录物。将核酶和其底物按照2:1的比 例混合，37℃下，在含M扩+的反应缓冲液中让其反应约2小时。反应完毕将 产物进行变性聚丙烯酞胺凝胶电泳使不同大小的RNA分离，用电转膜法将其 转移到尼龙膜上。以核酶作用底物体外转录表达载体为模板进行PCR扩增， 扩增产物浓缩后采用随机引物法标记放射性DNA探针。经Northem-blot杂交 法证明C-RZ和TRZ都能对其底物产生切割作用。 在证明了所设计核酶的特异活性之后，进一步设计双价核酶基因PCR引 物。将双价核酶基因插入到pBI121的多克隆位点XbaI和SacI之间，构建 了双价核酶基因的植物表达载体pB-C-TRZ。重组质粒转化农杆菌LBA4404, 为下一步的遗传转化以至最终获得双抗CMV和TOW 的转基因番茄植株作 好了准备。 关键词:番茄;CMVTOMV:双价锤头型核酶;克隆 缩 写 词 及 英 汉 对 照 Amp Ampicillin 氨节青霉素 by basepair 碱基对 BSA Bovineserumalbumin 牛血清蛋白 cm centimeter 厘米 CMV cucumbermosaicvirus 黄瓜花叶病毒 CP coatprotein 衣壳蛋白 d day 天 ddH20 doubledistilledwater