分子克隆2017.10.15.pptVIP

分子克隆冯学召2017.10.17 概要 一： 二： 三： 四： PCR（Polymerase chain reaction） 1.引物 2.dNTP（4种dNTP混合物） 3.模板（cDNA） 4.酶（Taq DNA聚合酶） 5.缓冲体系（Buffer） Primer design 一： （1）引物长度一般为18～30bp； （2）碱基随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象 G+C 含量：40％～60％ ； （3）避免发卡结构形成，引物自身存在的连续互补 序列一般不超过3bp； （4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免 3＇端的互补重叠； （5）引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性 （或低于70% 的同源性）; （6）引物的3＇端无修饰，并尽量避免第1位碱基为A， 且第1、2位碱基一定要与DNA模板配对; 引物5＇端 可以修饰； (7)上、下游引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。 二：SnapGene Viewer Myosin1d-primer 模板-cDNA 一：真核细胞mRNA的提取 二：cDNA文库的建立 反转录PCR，RT-PCR是将RNA反转录和PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA，然后以cDNA分子为模板,在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制，使目的cDNA片段得到扩增。 载体-质粒的组成部分 质粒的线性化处理及目的基因的纯化 一：空载质粒需进 行线性化处理 二：线性化处理的质粒 和RT-PCR获得的cDNA 进行电泳及胶回收 （DNA胶回收试剂盒） 目的基因载体的构建及转化 一：cDNA 二：线性化质粒 三：DNA连接酶 四：Buffer 质粒的转化技术 1.吸附（30min） 2.热激（90s） 3.冷缩（3-5min） 4.摇荡1h 5.涂板 6.孵化（12-16h） 7.挑克隆 8.摇荡过夜（12-16h） 9.提质粒（大提、中提、小提） 构建载体的测序 1.转化成功的表达载体进行挑克隆及细菌-PCR电泳 2.电泳阳性的载体进行测序 Maker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 电转（电转仪） 转染（化转Vigo法） 基因敲除细胞系的建立 One. Gene Knockout Mediated by CRISPR-Cas9 System(Cas9-2hitKO) Two. PX459M Three. Electric transfer buffer Map for PX459M Diagram of Cas9-2hitKO system 电转目标质粒进入NRK细胞 1.NRK细胞 2.电转液 3.px459-pSpCas9-2A-Puro-MCS 4.gRNA-Myosin1d 5.点击杯