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脂质体转染实验步骤 脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 1、操作步骤（方法一）： （1）细胞培养：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 10^5个细胞的培养基，37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。 （2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的量）。 A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。 B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。 轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 （3）转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。 （4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。 （5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。 （6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）： ?????????将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。 ?????????在试管中配制DNA-脂质体复合物。 a、在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。 b、旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。 c、室温下放置5-10min，使DNA结合在脂质体上。 ?????????弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物，37℃培养3-5天。 ?????????再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24h。 ?????????吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培养24-48h。 ?????????用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。 3、稳定的脂质体转染法： ?????????接种细胞同前述，细胞长至50%板底面积可用于转染。 ?????????DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。 ?????????在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培养48h。 ?????????吸出DMEM，用G418选择性培养基稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。 细胞转染技术总述 一、细胞转染途径 转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于物理介导技术；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体?转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 1、??? 物理介导 （1）??? 电穿孔法：靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞。 优点：转染效率较高 缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。 （2）显微注射：借助显微注射器直接把DNA注入核内，使之整合入受体细胞基因组中。 优点：转染效率高，可用于瞬时转染和稳定转染 缺点：导入DNA时需要一个细胞一个细胞注射，不适合大量转染 （3）基因枪：依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内。 2、?化学介导 （1）磷酸钙共沉淀法： 磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合，氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。 优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染。 缺点：转染效率低：进入细胞的DNA只有１％－５％可以进入细胞核，其中只有不到１％的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、