基因工程(94页).ppt

基因工程 Gene Engineering;主要内容;1、基因工程原理;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE);Ⅱ型酶（用途最广）;限制酶（Ⅱ型）;限制性核酸内切酶;限制性内切酶造成粘性末端 有利于重组DNA 分子的构建;DNA连接酶(DNA ligase);限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子的操作过程; 大多数的DNA片段不具备自我复制能力，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，就必须将DNA片段连接到一种具有自我复制能力的DNA分子上，这种DNA 分子就是载体。;载 体（Vector）;作为载体的条件 ;;返回;λ噬菌体;用噬菌体DNA构建重组DNA分子;逆转录酶（reverse transcriptase）; 1972年，美国斯坦福大学Berg博士领导的一个研究小组，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，基因工程从此诞生。;基因工程的基本内容;基因工程的主要步骤;1. 目的基因的获得;直接分离法：鸟枪法（散弹射击法） shotgun approach ; 化学合成：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。 ; 到哪里去找目的基因？一般来说，人的基因，要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从小鼠的组织细胞中去找。 从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因，称为基因文库。文库中基因总数 就人来说约有 5－10 万个基因。如何从中把需要的基因找出来？采取“钓”的办法。这个办法通常称为印迹法。;基因文库构建流程图;印 迹 法;印迹法的主要步骤：（1）基因文库－ DNA 用限制性内切  酶处理。（2）DNA 片断混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰  纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片断DNA 作为探针，  互补结合需要找的基因片断。（5）探针DNA 片断已用放射性元素 标记，使胶片感光后可看出。; 印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片断去寻找（“钓”）大的未知的基因片断。 探针 DNA 片断从何而来？ 根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中 N－端 15－20 个氨基酸序列，按三联密码转为 40-60 核苷酸序列，即为探针 DNA 片断。;返回; 多聚酶链式反应/聚合酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction);“I do my best thinking while driving”; 聚合酶链式反应:利用酶促反应在体外大量、特异性扩增DNA片段。把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。;three steps:;PCR 反应分三步完成：第一步 —— 90 0 C 高温下，使混合物的DNA 片断因变性而成单链。第二步 —— 50 0 C 温度下，引物 DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步 —— 70 0 C 温度下，由合成酶（ DNA 高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因 DNA。;;聚合酶链式反应;5?;25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。; PCR 的三个步骤为一次循环，约需5－10 分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。;逆转录法获得真核目的基因;方法Ⅰ：①合成cDNA第一链 5’~~~~~~~~~~~~~~~~~~AAAAAA 3’ mRNA TTTTTTT 5’ cDNA 1 Oligo(dT)，反转录酶 　　　　　　　　　　 d NTP, ②合成cDNA第二链 ~~~ ~~~ ~~~ AAAAAA 3’ cDNA 2 TTTTTTT 5’ RNase H，DNA聚合酶, dNTP