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circRNA 研究技术手册 一、circRNA 概述 circRNAs （Circular RNAs，环状RNA 分子）是一类不具有5末端帽子和3末端poly(A) 尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA 分子。circRNA 是区别于传统线性RNA 的一 类新型RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。大部分的环状RNA 是由外 显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。 由于环状RNA 对核酸酶不敏感，所以比线性RNA 更为稳定，这使得环状RNA 在作为新型 临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。目前对于circRNA 的研究还只是冰山一角， circRNAs 的生物学功能也有待挖掘，因此是非常值得深入的研究方向。 二、常规的circRNA 研究思路如下图所示。 图1circRNA 常规研究思路 1 22 1、circRNA 的已知功能有如下3种： 1）调节miRNA 活性-ceRNA 作用模式； 2）调节选择性剪接 （alternative splicing）-与pre-mRNA 竞争剪接； 3）调节RNA 结合蛋白 （RBPs）的存储，分类和定位-与蛋白直接结合； 上述三种circRNA 机制作用方式，2）和3）由于需要用到RIP 或RNApull-down，实 验执行难度大风险高，而 1）调节miRNA 活性-ceRNA 作用模式的可行性及阳性率较高，是 目前研究最热门的circRNA 作用方式。 2、汉恒生物circRNA 研究团队，为您提供基于ceRNA 调控机制的circRNA 系统研究方案。大致流程如下： 1）验证circRNA 的表达水平； 2）通过网络数据库，预测circRNA 可能结合的miRNAs； 3）circRNA 结合的miRNAs 的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证； 4）miRNA 靶基因预测与功能富集分析； 5）miRNA 靶基因的筛选、验证及相关功能研究； 6）circRNA-miRNA-mRNA 调控网络的验证。 图2 汉恒生物circRNA 研究流程示意图 2 三、汉恒生物-circRNA 研究实例 circRNA名称 hsa_circ_000244 研究方向 前列腺癌 研究步骤解析： 1、验证circRNA 的表达水平： 以前列腺癌组织和癌旁组织的cDNA 为样本，qPCR 验证hsa_circ_000244 的表达量及是 否成环。 汉恒生物拥有最成熟的circRNA-qPCR 验证技术，可设计特殊的circRNA 验证引物，既 可验证circRNA 表达水平，同时又能区分成环与未成环RNA。 2、通过网络数据库，预测hsa_circ_000244 可能结合的miRNAs： 3 ： 市 东 蔡伦路 50 地址 海 浦 新 号 号 上 区 1 1 2 汉恒生物科技(上海)有限公司 楼 楼 3、circRNA 结合的miRNAs 的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证： 将hsa_circ_000244序列克隆构建至报告基因载体psiCHECK，合成上述预测到的miRNA mimics及对照，在293T细胞内同时转染miRNA mimics和psiCHECK-hsa_circ_000244，多 功能酶标仪检测报告基因的表达水平，并筛选报告基因表达下调的miRNAs （可能有多个， 本例中假定选择hsa-miR-301a-3p 进行后续研究）。