cDNA-AFLP具体步调[宝典].docVIP

3.2.3双链cDNA的合成及精制 (1).第一链cDNA的合成采用TaKaRa公司一链合成试剂盒进行，具体操作如下： 在PCR管中加入下列反应成分：总RNA约5μg，Oligo(dT)18（50μmol/L）1μL， dNTP（10 mmol/L）1μL，DEPC-H2O补足10μL。 于65℃变性5 min，置于冰上2min。 向上述PCR管中继续加入下列成分：5×RT Buffer 4μL，RNase Inhibitor（40 U/μL） 0.5μL，M-MμLV Reverse Transcriptase（5 U/μL）1μL，dd H2O 4.5μL，总体积20μL， 混匀稍离心，42℃温浴1 h，70℃15 min使酶失活，直接进行第二链合成。 42℃恒温1 h，70℃水浴10 min，然后置于4℃冷却。然后进入第二链的合成 (2).第二链cDNA的合成使用DNA polymeraseⅠ（TaKaRa，大连）和RNase H （TaKaRa，大连）进行，体系如下: Component volume cDNA第一链 10.0μL 反应buffer 14.0μL dNTP(10mM) 1.5μL DNA PolymerseⅠ（4U/μL） 3.5μL RNase H（10U/μL） 0.2μL DNA连接酶(350u/μL) 0.3μL dd-H2O 10.5μL Final volume 40.0μL 轻轻混合，稍离心，PCR仪上16℃反应2.5 h，70℃终止反应10 min。 加入0.4μLT4DNA聚合酶，轻轻混合，PCR仪上37℃反应10min。 加入5μL 200 mmol/L EDTA终止反应。 (3).双链cDNA的精制 向第二链合成产物中加入50μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液，剧烈混匀，室 温12000 r/min，离心10 min。 将上清转入另一离心管中，加入100μL预冷（-20℃）的异丙醇，-20℃放置2 h以 上。 4℃，12000 r/min，离心15 min，弃上清，沉淀用沉淀用75％的乙醇（4℃放置）洗 两次。 沉淀风干5-10 min，加入10－20μL的ddH2O溶解。 用1.5％的琼脂糖快速电泳检测，并测定OD值。 -20℃保存备用。41 3.2.4 cDNA-AFLP差异显示 3.2.4.1限制性酶切 酶切体系参照内切酶说明书进行。 (1).TaqⅠ酶切： 在PCR管中加入模板cDNA约200 ng，10×RL Buffer 4μL，TaqⅠ酶（20u/μL） 0.5μL，ddH2O补足40μL，混匀，稍离心，65℃反应2 h。 (2).AseⅠ酶切： 在上述管中继续加入以下成分：10×RL Buffer 2μL，AseⅠ酶（20u/μL）0.5μL， ddH2O 7.5μL，总体积50μL，混匀，稍离心，37℃反应2 h。 3.2.4.2接头连接 向酶切产物中继续加入下列成分：TaqⅠ接头（25pM）2μL，AseⅠ接头（5pM）1 μL，ATP(10mM)0.5μL，T4 DNA Ligase Buffer 0.5μL，T4 DNA Ligase(350u/μL)0.2μL， ddH2O 0.8μL，总体积55μL，混匀，稍离心，37℃，3h。连接反应结束后于-20℃保 存。 注：TaqⅠ接头分别由T1和T2等莫尔浓度配制，AseⅠ接头分别由A1和A2等莫 尔浓度配制. 3.2.4.3预扩增 预扩增体系为： Component volume cDNA酶切连接产物5.0μL 10×PCR buffer 2.0μL Mg 2+ (25mM)2.0μL dNTP(10mM)0.5μL 预扩引物A3（20μM）1.0μL 预扩引物T3（20μM）1.0μL Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.15μL ddH2O 8.35μL Final volume 20μL 混匀，稍离心，进行PCR扩增反应。扩增程序为94℃2min；94℃30s，56℃30s， 72℃60s，共25个循环；72℃10min。 结果取5μL，用1.0％的琼脂糖检测。 3.2.4.4选择性扩增 预扩增产物稀释20×后进行选择性扩增，其体系为：42 Component volume 20×稀释的预扩增产物2.0μL 10×PCR buffer 2.0μL Mg 2+ (25mM)2.0μL dNTP(10mM)0.5μL 选扩引物A（20μM）1.0μL 选扩引物T（20μM）1.0μL Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL ddH2O 11.3μL Final volume 20.0μL 混匀，稍离心，进行PCR扩增反应，扩增程序为9