DB—2006猪RN基因的PCR-RFLP检测方法.docVIP

DB35/T XXX—2006 目 次 前言………………………………………………………………………………………Ⅱ 1、范围……………………………………………………………………………………1 2、实验室条件……………………………………………………………………………1 3、试剂的准备……………………………………………………………………………1 4、操作程序………………………………………………………………………………2 5、结果判定………………………………………………………………………………4 附录A………………………………………………………………………………………5 附录B………………………………………………………………………………………9 附录C ……………………………………………………………………………………10 附录D………………………………………………………………………………………11 前 言 本标准由福建省农业厅提出。 本标准由福建省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：福建省畜牧兽医总站。 本标准主要起草人：梁全顺、沈华伟、关育芳、黄雁、黄佳佳、徐忠林。 猪RN基因的PCR-RFLP检测方法 范围 本标准规定了RN基因检测采样要求、检测程序、判型标准等。 本标准适用于各品种猪的检测。 2、实验室条件 2.1、实验室应配备的仪器 分析天平、台式高速冷冻离心机、PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪、水浴锅、紫外凝胶成像仪、微波炉、-20℃冰箱、单道和多道加样器（10、20、50、100、200、1000μL）。 2.2、实验室分区 PCR整个实验分PCR反应配制区—配液区、模板提取区、扩增区、电泳成像区。流程顺序为 配液区/DNA模板提取区/扩增区/电泳成像区，严禁器材和试剂倒流。 2.3、注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，实验中被EB污染的物品要用有专门收集处，用高锰酸钾溶液或其它措施进行无害化处理。 3、试剂的准备 3.1、试剂 3.1.1、变性液见A.1 3.1.2、Tris-饱和酚 3.1.3、酚/氯仿/异戊醇混合液见A.2 3.1.4、氯仿/异戊醇混合液见A.3 3.1.5、Taq DNA聚合酶（5U/μL） 3.1.6、1.0%琼脂糖凝胶见A.4 3.1.7、15×TBE缓冲液见A.5 3.1.8、溴化乙锭（10μg /μL）见A.6 3.1.9、加样缓冲液见A.7 3.1.10、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水见A.8 3.1.11、2.5mmol dNTPS见A.9 3.1.12、10×buffer见A.10 3.1.13、DNA分子量标准 3.1.14、30％丙烯酰胺见A.11 3.1.15、8%聚丙烯酰胺凝胶胶板见A.12 3.1.16、TE缓冲液见A.13 3.1.17、0.5M乙二銨四乙酸二钠（EDTA）溶液见A.14 3.2、引物 见附录B。 4、操作程序 4.1、样品的采集和处理 每头猪抽血2～4ml置于含有抗凝剂的试管中（注意混匀），耳组织样取2.0克左右，置于75％的酒精中，并在4℃下保存。 4.2、DNA的提取 4.2.1、从血样中提取DNA 4.2.1.1、取0.6ml血样置于2.0ml样品管中，加1ml细胞裂解液混匀。 4.2.1.2、加2ulRnBAe酶 ,在37度水浴2～3h； 4.2.1.3、再加蛋白酶K（10mg/ml），至终浓度100ug/ml，混匀后在56度水浴锅水浴10～12h，到液体清亮为止。 4.2.1.4、冷却后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）反复混匀10分钟，然后12000rpm离心、4℃离心20min，将上层含DNA的水相移进一个新管。为降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不用吸取水相的最低层，重复抽提两次。 4.2.1.5、再加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）反复混匀10分钟，然后12000rpm离心、4℃离心20min，将上层含DNA的水相移进一个新管。为降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不用吸取水相的最低层，提取一次。 4.2.1.6、加等体积的无水乙醇，充分混匀液体，在-20℃沉淀1 h或更长时间。 4.2.1.7、12000rpm离心、4℃离心20min，弃上清夜后用70%的乙醇漂洗两次，离心后弃上清夜等乙醇挥发后，加TE进行溶解，在-20℃储存备用； 4.2.2、从耳组织样中提取DNA 4.2.2.1、取搅碎耳组织样1.0～2.0克置于2.0ml样品管中，加1ml细胞裂解液混匀。 4.2.2.2、加2ulRnBAe酶 ,在37度水浴2～3h； 4.2.2.3、再加蛋白酶K（10mg/ml），至终浓度100ug/ml，混匀后在56度水浴锅水浴10～12h，到液体清亮