试验目的1熟悉荧光显微镜的原理用途和使用方法2掌握荧光.DOCVIP

实验目的　　1. 熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方法。　　2. 掌握荧光显微镜的调校方法。实验器材　　荧光显微镜一台，荧光染色标本，擦镜纸，吸水纸，载玻片，盖玻片等。实验原理　　荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光，激发检测标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，通过物镜和目镜系统的放大以观察标本的荧光图像的光学显微镜，是医学检验中的重要仪器之一。 仪器描述　　荧光显微镜是由荧光光源、荧光镜组件、滤板系统和光学系统等主要部件组成。其基本结构见图6-1。　　 　　（一）荧光光源　　现在多采用200W的超高压汞灯作荧光光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外光和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。　　（二）滤色系统　　滤色系统是荧光显微镜的重要部位，主要由激发滤光片和阻断滤光片组成。激发滤光片，位于光源和标本之间，仅允许能激发标本产生荧光的光通过，激发滤光片有四组：紫外光(U)、紫光(V)、蓝光(B)、绿光(G)；阻断滤光片，位于标本与目镜之间，可吸收和阻挡激发光进入目镜并把剩余的紫外线吸收掉，以免干扰荧光和损伤眼睛，还可选择并让特异的荧光透过，只让激发出的荧光通过，这样有利于增强反差。激发滤光片和阻断滤光片必须选择配合使用。　　（三）反射荧光装置　　通过反射荧光装置将激发光经过物镜向下落射到标本表面。其反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%，一般使用平面反光镜。　　（四）聚光镜　　专为荧光显微镜设计制作的聚光镜是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。　　根据成像光路的特点，荧光显微镜可分为透射荧光显微镜和落射荧光显微镜。　　透射荧光显微镜激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野聚光镜，也可用普通聚光镜，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上。这是比较旧式的荧光显微镜。但在低倍镜时荧光强，所以对观察较大的标本材料较好。　　落射荧光显微镜是激发光从物镜向下落射到标本表面，物镜起着照明聚光镜和收集荧光的作用。光路中双色束分离器与光轴呈45°角，把激发光反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，再返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光被阻断滤片吸收。选择不同的激发滤光片／双色束分离器／阻断滤光片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。落射荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。实验步骤（以XSJ-2荧光显微镜为例）　　1. 用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的电灯，除去显微镜的防尘罩，确保显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜臂连接。　　2. 将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。　　3. 打开电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的±5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一次启动未点燃汞灯，可以多揿动几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到最大发光效率，即可开始工作。　　4. 灯泡的调中：　　（1）任选一块标本放在载物台上.　　（2）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光（Ｖ）或蓝光（Ｂ）或绿光（Ｇ）激发滤色片组转入光路，并将25×荧光物镜转入光路。　　（3）调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。　　（4）前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至最大。　　（5）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰。　　（6）调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中。　　（7）调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开。　　（8）转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。　　5. 荧光观察：　　（1）将荧光染色标本放到载物台上。　　（2）将10×平场物镜或25×荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。　　（3）转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路。激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上。　　滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用