猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ4株感染性分子克隆的构建.pdf

摘要 猪繁殖与呼【!!乏综合征是由猪繁殖与呼吸综合祉瘸毒(Porcine and reproductiverespiratory vims，PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病，给养猪 syndrome 业带来了巨人的经济损失。本研究利刚反向遗传学操作技术，构建了PRRSVBJ．4株的全长cDNA 克隆，并对全长cDNA克隆中存在的23个突变位点进行了同复突变．继而对突变后的全长cDNA 克隆体外转录体的感染性进行了研究。为将来实现在DNA水平上对PRRSV基因组的人工操作， 从而在分子水平上研究PRRSV的复制和致病机理、基因产物的功能等提供技术手段，并为构建 新型的病毒载体和发展安全有效的活病毒疫苗奠定基础。 bp、3，484 bp和2，887 bp。通过优化RT-PCR反应条件，最终扩增出其全基因组cDNA片段。并将它们分 SK+载体。然后将获得的6个克隆依次连接并克隆到 别克隆入pGEM-TEasy载体或pBluescript 两端和中间引入了病毒序列中不存在的单酶切位点．并在序列的5’端引入了SP6RNA聚合酶 启动子序列以及一个外源的…G，在3’端引入了poly(T)∞序列。 对扩增出的覆盖PRRSv全基因组cDNA的6个片段分别进行序列测定，并与其原始病毒 爿j定向点突变方法。对这些碱基进行了回复突变，得到包含PRRsv各eDNA重叠片段的6个 克隆，经序列测定证实，这6个克隆在成功恢复23个变异碱基的同时，来引入新的突变。将它 们依次连接井克隆到低拷贝质粒载体pWSK29中．获得了该毒株定点突变后的全长cDNA克隆 P1P2mP3P舡63。 制性内切酶跏^I酶切线性化后，作为体外转录模板。转录出的RNA用DNaseI消化模板质粒 续培养3代，在传至第2代时能产生典型的细胞痛变。经RFPcR和间接免疫荧光鉴定。证实获得 了有感染性的恢复病毒．表明成功地构建出了具有感染性的PRRSV全长cDNA克隆。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；全长eDNA克隆：基因组定点突变：感染性RNA 体外转录 Abstract thecausativeof Porcine and PRRS．It respiratorysyndromevirus(PRRSV)isagent reproductive causesan diseasein characterized failureinsowsand and important pigs byreproductive gilts dieases in economiclossestotheswine in respiratory piglets，resultinggreat industry．Thepresent article establishmentofaNinfectious cloneof BJ4 describesthe eDNA PRRSV full—length by of reverse mutation23·nucleoitidemutations util