实验3浊度测定(分光光度计的使用).pptVIP

实验目的 掌握分光光度计法 掌握浊度计法的原理与操作技术 仪器 容量瓶 比色管 浊度计 分光光度计 试剂 硫酸肼溶液：称取1.000g硫酸肼溶于水，定容至100ml 六次甲基四胺溶液：称取10.000g六次甲基四胺溶于水，定容至100ml 标准溶液：吸取5.00ml硫酸肼溶液和5.00ml六次甲基四胺溶液于100ml容量瓶总，混匀于25度反应24h，用水稀释至标线。 无浊度水 了解分光光度计的工作原理及操作技术 原理 光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。 依据Lambert-Beer（朗伯－比尔）定律，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。 当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。 补充知识 测量后的计算方法 ７２１型可见分光光度计 双缩脲法测定蛋白质浓度原 理 双缩脲法是蛋白质光度分析法的一种，是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。 在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 试剂 一 试剂 1．标准酪蛋白溶液（5mg/ml） 用0.05mol/L NaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml。 2．双缩脲试剂 　　　　溶解1.5g硫酸铜（CuSO4 · 5H2O）和6.0 g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6 · 4H2O）于500ml蒸馏水中。在搅拌下加入10% NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。 3．未知蛋白质溶液 　　　　γ–球蛋白溶液。 实验结果 　　　求出待测蛋白质溶液的光密度后，从标准曲线上查出其蛋白质浓度，按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量。 紫外分光光度计 浊度计法 1.定标用蒸馏水定出仪器的零点,再用此零点测量空气,得到参数值.称为定标值.以后在测量时,只要用调整旋钮将数字精确调到定标值方可直接测量. 2. 测量用待测液冲洗样槽注入待测液至液位线.擦干样槽外侧,将读书调到定标值,选好档位.将样槽放入样槽室,管束样槽门.此时显示屏上的读数就是待测液的实际浊度. * * 浊度的测定 　　具体测量时， 使用 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。 吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法测蛋白质含量