第11章荧光分析法-2012秋.ppt

第十一章 荧光分析法 （fluorometry) green fluorescence protein 荧光与荧光分析法（fluorescene and fluorometry) 荧光（fluorescene): 物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低能级返回基态时发射出的光。 荧光分析法（fluorometry)： 根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵敏度高，检测限达10-10g/ml,甚至10-12g/ml。 电子能级的多重态 激发态→基态的能量传递途径 激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluorescence spectrum GFP的激发光谱与荧光光谱 激发光谱与发射光谱的关系 荧光的产生与分子结构的关系 长共轭结构 刚性平面结构 取代基 第一类：增加分子的?电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长增长。如 -NH2、-OH、-OCH3、-NHR、 -NR2 、 -CN。 第二类：减弱分子的?电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。如：-COOH、-NO2、 -X、 -NO、 -C＝O、-SH。 第三类： 对?电子共轭作用较小，对荧光的影响不明显。如：-R、-SO3H、-NH3+。 荧光试剂 能与弱荧光物质或无机离子反应生 成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析 法的应用范围。 荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。 邻苯二甲醛（OPA）：测定伯胺、α-氨基酸。 丹酰氯:测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱 测定无机离子的荧光试剂 影响荧光强度的外部因素 影响荧光强度的外部因素 溶液的荧光测定 定量依据 定量分析方法 校正曲线法 配制标准溶液系列，分别测定系列中各溶液的荧光强度F，作校正曲线F-C图，根据待测溶液的Fx值，在图中求出待测液的Cx。若空白溶液的荧光强度不能校正到0，则须作 （F-F0）-C图。 定量分析方法 比例法 荧光计 荧光法应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 荧光法应用 2. 有机化合物的荧光分析 荧光分析法主要应用于有机物、生化 物质、药物的测定（200多种），包括： 有机化合物如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环芳烃、氨基酸、蛋白质等。 药物如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄碱等。 维生素如：维生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、叶酸 等。 甾体、抗生素、酶、辅酶 等。 荧光分析新技术 激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析 * 2008年诺贝尔化学奖 －绿色荧光蛋白（GFP） 科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质 GFP标记的微管 电子能级的多重度：M=2S+1 S 为电子自旋量子数的代数和(0或1) M=1，单重态，用S表示（single state） M＝3，三重态，用T表示（triplet state） ↑↓ ↑ ↑ ↑ ↓ 能 量 单重基态 激发单重态 激发三重态 禁阻跃迁 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 (10-8 s) 发 射 磷 光 (10-4 s) 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ?2 体系间跨越 振动弛豫(10-12 s) 内转换 传递途径 辐射跃迁 荧光 内转换 外转换 体系间跨越 振动弛豫 无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s， 第一激发三重态的最低振动能级→基态 磷光 1.荧光(磷光)的激发光谱： 固定测量波长,化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。 2.荧光(磷光)的发射光谱：固定激发光波长, 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线。 nm F 200 260 320 380 440 500 560 620 荧光激发光谱 荧光发射光谱 磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 1.Stokes位移 荧光发射波长大于激发波长的现象。 内转换和振动弛豫是主要原因。 2.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量,产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基