扫描电子显微镜-七年制.ppt

扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM) 生物电镜技术 利用扫描式电子束和二次电子成像，显示样品表面结构的电镜。 “扫”:指用一定能量和电流密度的细聚焦电子束，以一定方式和速度在样品表面逐点移动，产生二次电子信号的过程。 “描”:指将产生的二次电子信号检测出来，经过电学处理以亮暗图像的形式进行观察和描记。 扫描电镜的特点(与透射电镜比较) *用于观察组织细胞表面形貌 （三维立体图像） *景深长，立体感强 *放大范围广 *样品室较大，可观察块状样品 *样品制备过程简单 *多用于进行元素分析 扫描电镜的基本结构 电子光学系统 扫描系统 二次电子检测系统 显示记录系统 真空系统 电路系统 一．电子光学系统（一）电子枪 是电镜的照明源，可产生入射电子并使电子加速。由阴极（钨丝）、栅极和阳极组成。  （二）磁透镜系统 　　 可会聚和缩小电子束，形成细聚焦的电子束，直径10nm又称为电子探针。 　　包括:第一聚光镜 第二聚光镜 物镜 （三）样品室 　　内有样品台和放置各种检测器的窗口。　　　　　　　　　　　　　 　　样品台可容纳大小不同的样品，并在五个方位移动： 　　X；Y；Z； -5°～+45°倾斜； 360°旋转。 二．扫描系统 　 由电子束偏转机构（线圈）和扫描波电压发生器组成。 控制电子束在样品上以一定方式和速度移动；控制显示器上的电子束与样品上电子束移动同步；调整放大倍数。　　M=荧光屏尺寸/电子探针在样品上扫描范围 　三．二次电子检测系统 收集体：收集二次电子； 闪烁体：加速电子，使荧光屏发光， 将二次电子转变为光信号； 光电倍增管：将光信号转变为电信号； 视频放大器：将电信号放大，并送到 显示器荧光屏上。 　 四．显示记录系统 　　 　　　　由两个显像管组成。 一个用于观察，一个用于照相记录。  扫描电镜的成像原理 扫描电镜是利用二次电子成像，其反差是由样品中二次电子产率决定的。 影响二次电子产率的因素 电子束与样品法线的夹角（夹角大， 二次电子产率高） 样品组成的元素种类（原子序数高, 二次电子产率高） 样品本身电场和磁场（导电性能好，正电压区，二次电子产率高） 扫描电镜操作要点 1.启动电镜（同透射电镜） 2.安装样品：先将样品做好标记，置于样品台上，再送入样品室。 3.设定观察条件： 加速电压：15KV～20KV 加速电压。 电子束流：电子束流小，电子束口径细， 分辨率高，但亮度低。 调整物镜光阑：光阑要小。 4.观察图像 低倍状态下粗略检查样品的好坏。 通过调整样品台的方向选择所需的视野。 确定放大倍数（放大倍数取决于电子束在样品上的扫描面积）。 对图像进行聚焦和消像散,调节图像亮度和对比度。 5.照相 先过卷，再按快门。 自上而下扫描，时间在50～100秒之间。 扫描电镜生物样品制备 原则 尽可能保持生物样品的表面原貌。 去除样品内的水份，需经过脱水干燥过程，维持SEM的真空度。 增加样品的导电性，以提高二次电子的产率。 操作中要防止对样品的污染和损伤。 * 扫描电镜生物样品制备过程 　 表面观察法（较常用） 取材：快、小、轻、冷、准。 防止损伤组织表面； 有方向性，并做好标记;大小适宜。 清洗：目的是清除覆盖于样品表面的粘液、 分泌物、组织液、血液、细胞碎片及药物 反应沉淀物。 一般清洗法：0.9%NaCl或配制固定液的缓冲液 超声清洗法：l5000～ 25000Hz 0.5～ 15min 蛋白酶清洗法：采用胰蛋白酶或糜蛋白酶 离心清洗法：4000rpm/min 3～5 min。 固定： 目的是保持样品原貌；提高组织硬度，增强干燥时耐受表面张力变化的能力；提高样品表面耐真空和电子轰击的能力。 采用戊二醛-锇酸双重固定法 脱水：目的是利于保证金属镀膜装置和扫 描电镜镜筒的真空度，防止样品在真空状 态下损伤变形。 采用低表面张力的有机溶剂 （乙醇，丙酮）进行梯度脱水法。 干燥: 目的是去除样品中的水分和脱