实验指导手册[学生版]精选.docVIP

制药工艺学实验 学习指导书 （第六版） 西南科技大学 生命科学与工程学院 二○一二年二月  实验一 离子交换层析分离混合氨基酸 一.目的要求 学习采用离子交换树脂分离混合氨基酸的基本原理并掌握离子交换层析法的基本操作技术。 二.实验原理 离子交换层析法主要是根据物质解离性质的差异进行分离的方法。本实验用苯乙烯性季铵型阴离子交换树脂分离酸性氨基酸（天冬氨酸pI=2.77）以及碱性氨基酸（赖氨酸 pI=9.74）的混合液。在特定的 pH 条件下，它们与树脂的结合能力和解离程度不同，通过改变洗脱液的pH值或盐离子浓度可进行分离。 三.实验器材和试剂 1.苯乙烯性季铵型阴离子交换树脂（201×7，717型，100-200目天冬氨酸、赖氨酸 洗脱液（pH 4.2的柠檬酸缓冲液）：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml 5.氨基酸显色液（茚三酮溶液）：2g茚三酮溶于100mL无水乙醇中。 6.砂芯层析柱（Ф1×20cm）、试管（Ф1×12cm）及试管架（40孔）、铁架台（带夹）、胶头长滴管、牛角药匙、橡皮筋（捆试管）、250ml抽滤瓶（带砂芯漏斗）、称量纸、pH试纸（1-14）（0.5-5） 7.电子天平（千分之一）、恒温水浴锅、真空泵 四.实验方法 1.树脂的处理：100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 1mol/L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用ddH2O充分洗涤树脂至中性。加25ml 1mol/L NaOH 至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用ddH2O充分洗涤至中性。再用1mol/L盐酸浸泡2h，转型为Cl-型，最后再用ddH2O充分洗涤至中性备用。（教师准备） 2.装柱：取洁净干燥Ф1×20cm砂芯层析柱1支，用夹垂直固定于铁架台上，关闭下端出口，自顶部沿管壁缓慢加入ddH2O，待液面高于砂芯2cm处停止。然后自顶部缓慢沿壁用玻棒引流注入经处理的树脂的悬浮液（干树脂加少量ddH2O搅拌使树脂悬浮），待树脂沉降后，打开下端出口旋钮逐步放出过量的ddH2O（注意控制流速，保证液面高度不低于树脂层），再加入一些树脂，至树脂沉积至cm高度即可液面高出树脂表面1cm左右关闭柱子出口。 加样打开出口使流出，液面几乎平齐树脂表面时关闭出口（不可使树表面干）。用长滴管将氨基混合液到树顶部，打开出口使其缓流入柱内）。当液面刚平树脂表面时，保持流速／min每管20滴，管收存勿勿使树脂表面干燥。在收集脱液的过程中，检验氨基的洗脱情况方法于各管洗脱中加0滴，沸水浴中min，如溶液紫蓝色，表示已有氨基酸下来。显色的深度可代表浓度，可测定。再收集两管三反应性部分，关闭层柱出口，将树脂顶部的剩余移。树脂顶部加入，打开出口使其流入柱内按操作用并逐管收集（／），每管20。做氨基检，在第个氨基酸脱下来以后，再继续收集两三反应性部分。以洗脱液管颜色深浅（以、、、……表示）纵标，洗脱液管号为横坐标作图，出洗脱曲线。 1.装柱时须防止气泡、分层及面在树脂表面以下等现象发生。 21.离子交换树脂如何保存茚三酮反应茚三酮反应只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。 实验二 凝胶层析分离核黄素、蓝色葡聚糖和细胞色素C 一.目的要求 学习掌凝胶层析的工作原理和基本作技术。 凝过滤广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物高分子分离分析它是以分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。此类层的固相载体是具有分子筛性质的凝胶，目前使用较多的是具有各种孔径范围的葡聚糖胶（商品名为ephadex）聚丙烯凝胶（商品名为Bi）以及琼脂糖凝胶（商名为Seharose），此外有这些凝胶的各类衍生物。葡聚糖凝胶是由一定分子量的聚糖（右旋糖）和甘油基以醚桥（0-CH2-CH-CH2-O-）形式相互联形成三网状结构的一种水不溶性物质。通过控制交联剂环氧氯丙烷和0H 单体葡聚的配比以及交联时的反应条件控制交联而获得具有不同“网眼”的凝胶。“网眼”大小决定了分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围，可分离的分量从百到数万不等。 由于凝胶骨架中的多糖有大量OH基，因此凝胶具有极强的亲水性，能在水电解质溶液中胀。不同型号的交联葡聚糖用G表示（如G25，G等），G后面的数为凝胶的吸水（m干胶）乘以l得到的数，如G即表示此型号凝胶吸水量是ml／干胶。 进行工作时一般根据分离物质的大小及工作目的来合适的葡聚糖凝装层析柱。待分离的物质通过此柱时，各组分相互之间由于分子量大小各不相同以及在固定相上的阻滞作用的差异而在中以不同的速率移动。分子量大于允许进入凝胶“网眼”范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，移动速度快而先出层析；分子量小的物质可完全渗入胶颗粒，阻滞作用大，流程长，移动速度，从层中流出就较。若物质分子量介于