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实验一 实验仪器的介绍（4课时） 介绍本院已有的实验仪器和设备，使学生了解仪器设备的基本原理和操作方法。 实验二 质粒的提取和纯化（8课时） 实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。 实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。本实验选做的是碱法。 1. 裂解细胞 裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有Triton X-100等。 2．分离 即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。 3．纯化 细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白质可通过酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。 正确的去除蛋白质杂质的过程：应该是酚 → 酚+氯仿［(1:1)］→ 氯仿（或氯仿／异戊醇24:1)处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿／异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。 实验内容： 试剂 1.LB培养液(1L) 细菌培养用蛋白胨 10g 细菌培养用酵母粉 5g NaCl 10g 用10mol／L NaOH调至pH7.0，高压蒸气灭菌, 4℃贮存。 2．溶液Ⅰ，可成批配置，灭菌后4℃贮存。 葡萄糖 50mmol／L Tris-C1(pH8.0) 25mmol／L EDTA 10mmol／L 3．溶液Ⅱ(新鲜配制) NaOH 0.2mol／L SDS 1％ 4．溶液Ⅲ 5mol／L KAc 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 配制好的溶液Ⅲ含3mol／L钾盐，5mol／L 醋酸(pH4.8)。卡那霉素(Kana): 50mg/ml, 过滤除菌。 5．重蒸酚：市售苯酚蒸馏纯化(收集179～181℃之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。 6．氯仿:异戊醇(24:1) 7．无水乙醇 8．RNaseA(10mg／ml) 9．3mol／L NaAc(pH5.2) 10．TE：10mmol／L Tris-C1(pH8.0) 1mmol／L EDTA 材料 含有质粒(pNTE-EGFP, pEGFPN3)的大肠杆菌DH5a。 操作步骤 1．挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP, pEGFPN3质粒的单菌落，接种至5ml LB培养液(含Kana 50μg／m1)，37℃振荡培养过夜。 2．取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中，12 000r／min离心2min，弃上清。 3．将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液工中，强烈振荡混匀。 4．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖，轻轻颠倒混匀5次，冰浴5min。 5．加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10s，冰浴5min。 6．12 000r／min 室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5m1 Eppendorf管中。 7．加入等体积酚／氯