流式细胞分析分选术196孔板样本处理11操作流程-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.8.2.17 流式细胞分析分选术 1. 96 孔板样本处理 1.1 操作流程 接种细胞：3×104 /孔 药物刺激 一般作用24 小时，上机 1.2 方法 在cellquest 环境下，利用control 细胞标定上样条件，并在已设好的文件 夹(INS 文件及SET 文件)下，保存好需要的上样文件 关闭cellqest 软件， 打开MPM 软件 在MPM 软件下进行一系列设定(首先在Autosample 下， 进行SettingInitial 及FinalWashing 操作，清洗整个管路 管路清洗完毕进行 上样条件设定(主要设定上样体积(一般100ul)，混合体积(一般100ul)，混合次数， 清洗次数等，在Acquisition 菜单下设定current plate(现在使用的板号是353263)， DateStorageFolder( 即数据储存文件夹) ， AcquisitionDocument 及 InstrumentSettingsFile(上样条件从保存好的INS 及SET 文件中选定) 上样 条件设定完毕，选定96 孔板的上样范围 在Acquisition 下选择Acquire, 上样 上样完毕，退出上样板，使用次**钠及水，清洗管路(将次**钠 及水加在96 孔板上，以上样的方式清洗管路) *须知：如果使用PBS 作为上样鞘液，上样完毕后，换用水作为鞘液，并反复冲 洗管路，防止PBS 盐结晶堵塞管路。 1.3 注释 1) 必需的control ：应准备一管对于检测指标为阴性的细胞(例如：若要检测 Jurkat-NF-KB-GFP 经药物刺激样本，就需要准备一管Jurkat 细胞(GFP 为阴 性)) ，用于标定机器的上样条件。细胞量为1×106 个/ml ，1ml。 2) 上机前，应对样本进行混合，以使样本均一(注意使用排枪吹打，勿产生气泡) 。 3) 以上protocol 仅针对于悬浮细胞。 4) 药物刺激浓度需先做梯度检测。 第七章 流式细胞分析分选术 42 2. Cell Cycle Assay 常用的实验细胞株包括：293(T) ，MCF7 ，U2OS ，Saos，Hela 等 中国试剂网 3.8.2.17 以U2OS 细胞为例 2.1 细胞培养及铺板 1) 细胞株及材料： a) 细胞株： U2OS 细胞 b) 培养基： DMEM(10%FBS ，GBICO)，DMEM(无血清) c) 培养器皿：75cm2 培养瓶,6cm 培养皿 2) 细胞培养及铺板： a) 传代：用DMEM(10%FBS) 培养基接种U2OS 至75cm2 培养瓶，细胞长 满后铺板并传代。 注：一般一瓶细胞总数可以达到1×107 个 b) 铺板： 细胞消化：将培养好的U2OS 细胞，倾去培养基，加入2ml 1×胰酶轻轻 摇晃以覆盖整瓶细胞，37℃培养箱放置2-3min ，观察细胞从 瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁) ，显微镜下观测到细胞 成单个，或是只有2-3 个细胞聚团，即可以加入5ml 含有血清 的DMEM(10%FBS) ，终止胰酶的消化作用。 细胞计数：如果细胞密度较大，可按一定倍数稀释后计数。 细胞密度(单位：个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数 铺板： 6cm 培养皿按照每孔6×105 个细胞