免疫检测法及其应用课件.pptVIP

（1）将抗IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗IgM，洗涤。 （2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的IgM抗体被固相抗体捕获，洗涤。 （3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性IgM结合，洗涤。 （4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合，洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在特异性IgM抗体，是为阳性反应。 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复合体。 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。 3. 与固相抗原的竞争结合 取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液100μl，加入酶标板的抗原孔中，放入37℃恒温培养箱中60 min。洗板3次。 100ul 稀释板 酶标板 37℃，60 min 洗板3次 适用于 优点 注意 双抗体夹心法测抗原 是检测抗原最常用的方法，适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 特异性高 不能检测小分子抗原及半抗原 双抗原夹心法测抗体 乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法 受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法 关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 间接法测抗体 是检测抗体最常用的方法,本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体 1.关键抗原的纯度 2.另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体 竞争法测抗原 小分子抗原如激素和药物等ELISA测定多用此法。 快，只有一次保温洗涤过程 需要较多的酶标记抗原 实验材料： 羊抗人血清白蛋白抗体（一抗） 已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线） 待检人血清白蛋白 辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗） 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液 洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/L PBS 底物溶液：OPD-H2O2 终止液：2mol/L H2S04 酶标反应板（一条/人） 方法 适用于 竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检验特异性抗体 捕获包被法测抗体 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定 ABS-ELISA 法 ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。 制备纯化抗原或抗体 制备抗原或抗体包备液包被微孔板 制备酶标记抗体或抗原 制备酶催化底物 终止液 1.加样：加待检样品0.05ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育30分钟。 (设置空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔各加0.05ml对照标准)。 2.洗涤,新鲜配置洗涤液注满微孔, 停滞15秒弃去.重复5次. 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.05ml。37℃孵育30分钟. 4.洗涤,新鲜配置洗涤液注满微孔, 停滞15秒弃去.重复5次. 5.加底物液显色：于各反应孔中加入底物A液和底物B液各0.05ml，置37℃孵育15分钟。 6.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 7.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 固定OD值 包被抗原 抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标板中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜。 次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。 抗原100ul/孔 湿盒中，4℃过夜 酶标板 抗原与抗体的预孵育 制作标准曲线： 在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度的抗原最终为50μl，分别在各抗原孔中加入250μl一定浓度的抗体，放入37℃恒温培养箱中30 min。 待测抗原： 取50μl未知浓度的抗原按照同上操作。 待测抗原50ul PBS 50ul 50ul 稀释液 50ul 50ul 100ul 标准抗原 250ul抗体 稀释板 37℃，30 min * . . . 50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来