SOD工程菌的构建实验报告.docVIP

生物工程综合实验 -- SOD工程菌构建 实验报告集 班级 生物工程1411学号 姓名 实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作， 经指导老师许可后，方可离开。 预 习 报 告 名称 SOD工程菌构建 日期 201712.11-12.13 实验目的和要求：工程菌是利用基因工程的方法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中，使其得到高效表达。这种经改造后的细胞株称为工程菌。工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多方面具有重要作用。 SOD（超氧化物歧化酶），是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。人体在不断地补充SOD后会具有抗衰老的特殊效果，被卫生部批准为具有药物功能的物质。因此，采用工程菌的原理和方法，体外大量合成SOD，有利于降低其生产成本，扩大使用范围。了解PCR的原理和实验流程。了解质粒提取的原理和方法。了解酶切的原理和方法，单双酶切的区别，粘性末端连接和平端连接的差异。了解CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态及转化的原理。了解SDS检测蛋白质的原理和方法。 实验材料：pCM-T-SOD质粒、Taq DNA聚合酶、SOD特异性引物、dNTPs PET-32A质粒、质粒提取试剂盒SOD基因（PCR回收产物）、PET-32A质粒、EcoRV和HindIII限制性内切酶大肠杆菌DH5α，1M预冷的CaCl2溶液，LB培养基，30%甘油，氨苄青霉素转化成功的菌液，蛋白上样缓冲液，Tris-Hcl，10% SDS，TEMED，10% AP（过硫酸铵），30% 丙烯酰胺单体（29：1） 主要仪器： PCR仪 水平凝胶电泳仪 摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱 垂直电泳系统、水浴锅 主要步骤： 一.PCR扩增SOD基因及胶回收纯化 PCR扩增 在PCR管中，加入如下PCR反应物： 名称 体积（μl） 10×Taq buffer 5 SOD上游特异性引物 1 SOD下游特异性引物 1 dNTPs 1.5 质粒模板 3 Taq聚合酶 0.5 无菌水 38 总体积 50 2.PCR反应条件 95℃ 5min 95℃ 30s 30个循环 55℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 10min 4℃ Pause 1% TAE凝胶电泳 胶回收PCR产物 1） 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若得到目的条带可进行大批量PCR，回收目的片段； 2） 通过把切取含DNA片段的琼脂凝胶装在1.5 mL 小离心管中，称其重量近似地确定其体积，每100 mg琼脂凝胶相当于100 μL 体积。称量每次切取含DNA片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液BD； 3） 55～65 ℃水浴7～10 min直至胶完全融化，期间振荡3次，琼脂糖必须完全融化； 4） 将溶液置于DNA纯化柱中，静置2 min，12000 rpm离心60 s；若一次加不完，可分两次离心，弃滤液； 5） 加入500 μL 溶液PE（初次使用前用无水乙醇按1：4稀释）于离心柱中，12000 rpm离心60 s，弃滤液； 6） 用溶液PE 500 μL 再洗一遍，12000 rpm离心60 s，弃滤液；12000 rpm再次离心2 min，以甩干剩余液体； 7） 将离心柱置于新的离心管中，加入60 ℃预热的30～100 μL 溶液Eluent于纯化柱中（硅胶膜中央），静置2 min，12000 rpm离心60 s，管底即为回收DNA 8） 重复步骤7； 9） 无菌水溶解DNA，贮存于-20 ℃。 二1. 取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升???过夜菌沉淀。 2. 每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。 3. 每