生物化学实验指导-LSW.docVIP

实验一 植物DNA的提取与测定 DNA的原理和方法，进一步了解DNA的性质。 二、原理 细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例：RNP在0.14 mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4 mol/L NaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。 关于植物总DNA的提取主要有两种方法： 1． CTAB法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 2． SDS法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠）使DNA与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿DNA。 DNA为107~109 bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。 提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等 2．主要仪器 （1）高速冷冻离心机 （2）751型分光光度计 （3）恒温水浴 （3）液氮或冰浴设备 （4）磨口锥形瓶 3．试剂（CTAB法） （1）CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。 表1 CTAB提取缓冲液配制 M.W. 配制1 000ml 配制500ml Tris 121.14 12.114 g 6.057 g EDTA-Na2 372.24 7.4448 g 3.7224 g NaCl 58.44 81.816 g 40.908 g 用HCl调 pH值。 （2）TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。 （3）DNase-free RNase A: 溶解RNase A于TE缓冲液中，浓度为10mg/ml，煮沸10～30min, 除去DNase活性，－20℃贮存（DNase为DNA酶，RNase为RNA酶）。 （4）氯仿-异戊醇混合液（24:1，V/V）：240ml氯仿（A. R.）加10mL异戊醇（A.R.）混匀。 （5）3mol/L乙酸钠（NaAc，pH6.8）：称取NaAc·3H2O 81.62 g，用蒸馏水溶解，配制成200 ml，用HAc调pH至6.5。 （6）无水乙醇 TE缓冲液，Tris-HCl（pH8.0）液，NaAc溶液均需要高压灭菌。 四、操作步骤