胚胎培养——离体授粉与离体受精.ppt

胚胎培养——离体授粉与离体受精 主要内容 基本概念 发展历史 基本技术 影响因素 研究意义 当前热点问题 1、离体授粉 指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，也称试管受精。 基本概念 2、离体受精（IVF） 指在离体环境中完成被子植物的精、卵融合而且利用受精所产生的“离体合子”培养再生植株，做到整个受精与胚胎发育过程完全在离体条件下完成。 发展历史 50年代，人们尚难以想象植物雌雄配子可以进行体外操作，并实现融合。 60年代，在印度德里大学植物胚胎学实验室开创的将胚珠或子房在离体培养的条件下进行授粉和受精的方法，称为“试管受精” ，后来也常称为“离体授粉”。 80年代，人工受精的显微操作以及受精作用的体外模拟的产生。 90年代，用电融合法成功地进行了玉米雌雄配子体外融合，并将受精产生的“人工合子”培养成再生植株，这才是严格意义上的离体受精。 基本操作技术 （一）离体授粉技术 将未授粉的离体胚珠（带胎座或不带胎座）或子房接种在培养基上，然后在试管内撒播花粉。花粉发芽后，花粉管长入胚珠内受精。受精后的胚珠进一步发育成种子。 离体授粉根据授粉的部位不同可分为： 离体胚珠授粉 离体胎座授粉 离体柱头授粉 材料选择 以子房较大胚珠较多的植物较易成功。 基本步骤 1、采集花粉 在开花前一天或当天取花蕾或花药，表面消毒后，无菌条件下收集花粉。 2、剥取子房或胚珠 在开花前1~3天对用做母本的花蕾去雄并套上纸袋。开花的当天或第二天采集花蕾，对其表面消毒后，在无菌条件下去掉柱头和花柱，剥取胚珠或子房培养。 3、授粉 将花粉在无菌条件下授予培养的胚珠、胎座或雌蕊的柱头上。具体方法如下: （1）子房试管授粉 1）直接引入法 在无菌条件下，用锋利刀片将子房壁或顶端切开一个小口，把花粉悬浮液直接滴入切口后进行培养。 2）注射法 用无菌注射器吸取花粉悬浮液，从子房基部或上端切口注入子房（基部切口可用凡士林封口），然后接种于培养基上。 （2）胚珠试管授粉 1）哺育法 将胚珠表面蘸满有助于花粉萌发的培养基后进行接种培养，然后在胚珠上撒播花粉使之受精。 2）接近法 将花粉预先撒于培养基上培养使之萌发或不萌发，然后接种胚珠或子房培养。 离体受精技术 （一）配子分离 1、精细胞的分离 （1）渗透压冲击法：将花粉置于含一定浓度渗透压调节剂的介质（低渗溶液）中，任其吸水后自行破裂而释放精细胞。 （2）研磨法：适于抗低渗，不易破裂的花粉。将悬浮于一定介质中的花粉用玻璃匀浆器或其他装置轻轻研磨，使花粉破裂而有不损伤精细胞。 2、卵细胞的分离 （1）酶解法：酶解分离出胚囊后，再延长酶解时间，使卵细胞逸出。适于薄珠心胚珠或胚囊部分裸露的胚珠。 （2）直接解剖法：直接应用显微解剖技术从胚珠中分离卵细胞。适于较大的胚珠，具厚珠心的植物材料如禾本科植物。 （3）酶解—解剖法：胚珠先经酶解后，再在倒置显微镜下从胚珠中分离卵细，是最常用的方法。 （二）精卵融合技术 1、微电融合 85%融合率，只有此法融合的合子可培养成再生植株。 2、高钙—高PH介导融合 0.05mol/L CaCl2与PH 11条件下介导融合。 3、一般钙条件融合 4、PEG诱导融合 （三）合子培养与植物再生技术 培养方法——目前常采用微室饲养培养 将商品生产的微室置入饲养细胞的小培养皿中，培养物接微室内，通过室底部微孔滤膜吸取周围饲养细胞释放的活性物质，促进其发育。 喂饲细胞 未成熟胚悬浮细胞或小孢子细胞 喂饲细胞促进被饲养物生长的原因： 1）增加细胞密度 2）细胞旺盛分裂或分化过程中产生活性物质 ——生长促进因子(GPF)（维持细胞分裂、生长和发育所必需的） 从离体受精到植株开花约需100天，形成的籽粒具有正常发育的胚和胚乳。 目前，唯一一例离体融合产生的合子培养获得再生可育植株是在玉米中实现的。 影响因素 1、材料的选择及处理 子房较大胚珠较多，一般应切除柱头和花柱。 2、培养基 一般采用MS、Nitsch或B5培养基。 3、培养条件 研究意义 为受精生物学的重要理论问题的探索与解决开辟了新的途径； 用于遗传育种中可以克服自交不亲和性，进行作物改良。离体受精所能克服的是那些以花粉—柱头或花粉—花柱相互作用为基础的不亲和障碍，并不是万能的。 当前热点问题 利用离体受精系统研究受精与早期胚胎发生过程中的基因表达，是本领域研究由细胞水平进入分子水平的新趋势，主要工作是： 1. 构建D