第四章 酶(基础生物化学).ppt

酶促反应速度的测定与酶的活力单位 1、酶促反应速度的测定 初速度的概念 2、酶活力 3、酶活力的表示方法 4、酶活力测定方法：终点法 动力学法 检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、 浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。 酶活力测定方法 终点法: 酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。 动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。  酶活力的表示方法 活力单位（active unit） 习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位（IU）: 1μmoL变化量 / 分钟 Katal（Kat）：1moL变化量 / 秒 比活力= 总活力单位 总蛋白mg数 = U(或IU) mg蛋白 量度酶催化能力大小 转换系数（Kcat） 底物（ μ moL）/ 秒·每个酶分子 量度酶纯度 比活力（specific activity） 量度转换效率 影响酶反应速度的因素 2、底物浓度 3、pH （最适 pH的概念） 4、 温度 （最适温度的概念） 5、激活剂 6、抑制剂 1、酶浓度 当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=k[E] 底物浓度对酶反应速度的影响 1、酶反应速度与底物浓度的关系曲线 （Michaelis—Menten曲线） 2、米氏方程的提出及推导 3、米氏常数的意义 4、米氏常数的测定 单分子酶促反应的米氏方程及Km 推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照 “稳态平 衡”假说的设想进行推导。 米氏方程: 米氏常数: 酶促反应初速度的概念 斜率=[P]/t = V（初速度） [P] t 酶反应速度与底物浓度的关系曲线 米氏方程的推导 令： 将（4）代入（3），则： [ES]生成速度： ，[ES]分解速度： 即： 则： (1) 经整理得： 由于酶促反应速度由[ES]决定，即 ，所以 (2) 将（2）代入（1）得： (3) 当酶反应体系处于恒态时： 当[Et]=[ES]时， (4) 所以 米氏常数的意义 * 当v=Vmax/2时，Km=[S]（ Km的单位为浓度单位） * 是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的数值，可鉴别酶。 * 可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，E对S的亲合力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。 *在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意[s]时的v，或任何v下的[s]。（用Km的倍数表示） 练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为多少？ 米氏常数的测定 基本原则： 将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。 例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法） 米氏方程的双倒数形式： 1 Km 1 1 — = —— . — + —— v Vmax [S] Vmax 酶动力学的双倒数图线 pH对酶反应速度的影响 ?过酸过硷导致酶蛋白变性 ?影响底物分子解离状态 ?影响酶分子解离状态 ?影响酶的活性中心构象 pH 最适 pH v 温度与酶反应速度的关系 ? 在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快 ? 酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快 ? 酶的最适温度不是一个固定不变的常数 v 温度 激活剂对酶作用的影响 类别 金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子： Cl-、Br- 有机分子: 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA 凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator） 抑制剂对酶作用的影响 凡是使酶的必需基团或酶活性部位中基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质叫酶的抑制剂（inhibitor）。 类型：不可逆抑制剂 可