第四章、目的基因的制备.ppt

第四章：目的基因的制备;目的基因的克隆方法;一、直接酶切法从基因组DNA获取目的基因;步骤;DNA印迹杂交（Southern blot）示意图 ;二、化学合成法;（五）化学合成基因的局限性;;（六）长片段DNA合成技巧;小片段粘接法;补丁延长法;大片断酶促法;（七）化学合成DNA的应用;三、PCR扩增法 ;（三）PCR步骤;;PCR扩增;（四）PCR模板;（五） PCR引物的设计;发夹结构;引物二聚体;2、设计注意要点;2、设计注意要点;3、引物5′端设计策略;;4、引物设计方法;（五）常规PCR的局限性;（六）PCR扩增长片断DNA的策略;四、cDNA法-从mRNA获取目的基因;（二） cDNA法基本原理及步骤;真核mRNA分离纯化方法;mRNA的分离纯化程序;双链cDNA的体外合成;利用oligo-dT合成cDNA第一链;第二步：cDNA第二链的合成;自身合成法;;引物合成法;末端转移酶;引物－衔接头法合成双链cDNA;;（三）应用前提;五、逆转录PCR（RT－PCR）???;（三）RT－PCR程序;六、从基因组文库或cDNA文库中筛选;质粒文库;;考氏质粒文库;（一）菌落或噬菌斑原位杂交法;菌落原位杂交示意图;噬菌斑原位杂交示意图 ;原位杂交程序 ;5、用X光片通过放射自显影显示杂交反应位置 第二轮： 根据胶片上的斑点位置在原杂交阳性平板的相应区域挖下固体琼脂，用新鲜培养基洗涤稀释； 将稀释液再次涂布平板，使每块平板只含有200-500个可辨认的菌落或菌斑； 重复2－4步，准确挑出期望的重组克隆。;菌落原位杂交和噬菌斑原位杂交比较;（二）免疫学检测法;;（三）从两种基因文库获得目的基因的特点;（四）建库法举例;例一：麻风杆菌α2抗原基因的克隆及表达研究;例二、人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定 （第四军医大学学报2000年第21卷第2期 ）