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医学论文-小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良 【摘要】? 目的 建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法 改良酶消化法。结果 用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。结论 与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞 。 吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士 【关键词】? 小鼠 动脉血管平滑肌细胞 原代培养 ??? Abstract? Objective? To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC).? Methods?? Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion? Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity. ??? Key words?? Mouse? Aorta VSMC? Primary cult ??? 在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。 ??? 1? 材料与试剂 ??? 1．1? 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。 ??? 1．2? 试剂： 鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse??? IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。 ??? 1．3? 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％ 胎牛血清、１％青霉素、 链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。 ??? 1．4? 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)， 过滤除菌即用。 ??? 1．5? ７０％乙醇：用无菌蒸馏水配制。 ??? 1．6?? 器械、仪器：齿、平镊，组织、眼科剪，无菌注射器，培养皿，解剖显微镜（Paxcam,Vistavision），荧光显微镜(LEICA DMI6000B）。 ??? 2? 方法 ??? 2．1? 常规麻醉小鼠，70％乙醇冲洗颈部和腹部, 打开胸、腹腔 , 暴露心脏。 ??? 2．2? ５ mL 注射器穿刺左心室， PBS 缓冲液冲洗主动脉。 ??? 2．3? 完整分离主动脉，放入100 mm无菌平皿，滴1～2滴PBS 缓冲液。 ??? 2．4? 解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明（如粗糙不平说明外膜去除不干净）。 ??? 2．5? 取出血管，放入另一有 PBS 缓冲液的平皿里，转到超净工作台操作。 ??? 2．6? 眼科剪将血管快速剪成１～２ mm2? 大小后用胶原酶消化３～４ h（组织块变成细胞团即可）。 ??? 2．7? 加入 DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入1 ml 新鲜培养基重悬细胞，接种于１２孔培养板中的一孔，常规静置培养。 ??? 2．8? 第2天观察是否有细菌污染，如有要更换新鲜培养液，静置培养。于第５、６天细胞生长达培养皿面积的８０％左右时可传代，常规方法即可。 ??? 3? 细胞鉴定 ??? 免疫荧光法鉴定平滑肌细胞：常规消化，细胞接种于培养载玻片。第2天用PBS 缓冲液轻缓洗涤，加3.7％福尔马林液在室温下固定30 min后用PBS 缓冲液洗涤３次，２ min／次。然后用 0.1％ Triton-x-100 (PBS配制) 室温下渗透细胞10 min，以便抗体更好的进入细胞。用10％山羊血清(PBS配制) 封闭非特异性抗原30 min，鼠抗SMC-α-actin （1:200 PBS