荧光PCR快速检测试剂盒.ppt

荧光PCR快速检测试剂盒 主要内容 基础理论部分 实验操作部分 注意事项及其他 基础理论部分 基础知识 PCR原理与过程 PCR体系 荧光PCR PCR基础 1869年，核酸的概念Miescher从细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物…(DNA、RNA) 1944年，核酸是遗传物质 从S 型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降解，就不发生转化 PCR基础 1953年，DNA双螺旋结构 冈崎片段 DNA的半保留复制 1971年，Khorana提出体外扩增设想 1985年 ，Mullis发明PCR 耐热聚合酶 Mullis发明PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 实质：体外模拟DNA的复制过程 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 变性：打开DNA螺旋双链 复性：引物与模板结合 合成：Taq酶沿模板延伸 PCR的原理 ①模板DNA双链的打开（变性）：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，双链解离成为单链，便于与引物结合 ②模板DNA与引物的退火(复性)：当温度降至55℃左右，单链模板DNA可与引物配对结合 ③引物引导下新链的合成（延伸）：DNA模板--引物复合体在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则合成一条新链 PCR原理 ①变性 温度一般92oC-94oC,再高会缩短Taq酶半衰期 使用薄壁均匀离心管 时间取决于模板的复杂程度，前期一般1~5min。 GC%、空间结构、杂蛋白等 循环中变性一般15~60sec。对于模板没有纯化而扩增效果不好的，考虑延长变性时间注：热变性对DNA 有重大的损伤，因此有时候变性时间长反而产物量会减少。 PCR原理 ②退火 因为引物 模板，所以引物与模板配对的复性动力学系数远比模板复原的要大温度37oC-65oC甚至72oC（两步法）都有，视引物与模板的同源程度而定，一般使用比Tm值少5oC~ 10oC。如果引物与模板不是严紧配对，一个碱基错配约降低Tm 5oC。 Tm计算经验公式：Tm=2（A+T）+ 4（G+C）时间15~60sec。 PCR原理 ③延伸温度一般在72oC，因为是Taq酶反应最佳温度时间按扩增区段（目标产物大小）而定，一般15~60sec足够。 72oC时合成速度 1000bp/min Taq酶在70oC合成速度为60nt/sec 在55oC合成速度为24nt/sec 在37oC合成速度为1.5nt/sec 在22oC合成速度为0.25nt/sec含有酶的反应液操作最好在冰上进行 PCR反应体系 纯水（补够体积，使缓冲液为使用终浓度） 10×反应缓冲液（酶的作用环境） dNTP 引物 模板 Taq酶 探针（荧光PCR） PCR反应体系 反应缓冲液对于不同的模板引物，最佳缓冲条件有待摸索。常用 50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、1. 5 mmol/L MgCl2。Tris-HCl 在反应中pH会有变化，△ pKa为-0.021/oC 50mmol/L内的KCl有利于退火，高可能会抑制酶活有些反应使用NH4+代替K+(16mmol/L) PCR反应体系 反应缓冲液Mg2+浓度影响引物退火和酶的活性，高Mg2+增强复性，也增加非特异性，降低模板变性温度。Mg2+浓度 dNTP + 模板 + EDTA 浓度据报道，自由Mg2+浓度在0.7~0.8mM之间为好。有报道使用Mn2+代替Mg2+，但是会增加突变dNTP应等浓度配置 PCR反应体系 反应缓冲液中可加一些PCR促进剂明胶Triton X-100 稳定酶的活性BSADTT甘油DMSO 降低解链温度，提高反应特异性甲酰胺TMAC(氯化四甲基铵)gp32(T4噬菌体基因32蛋白)甜菜碱 PCR反应体系 dNTP 组成核酸长链的一个个小单元 dATP，dGTP，dCTP，dTTP，dUTP… 引物 一小段单链DNA 在Taq酶的作用下用于引导链的合成 UNG酶 在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。 引物设计 引物设计的目标是在扩增的特异性和扩增效率之间